Development and characterization of lipid nanoparticles with antibody-mediated targeting for breast cancer: evaluation in 2D and 3D cell cultures

The use of nucleic acid-based therapies has significantly increased in recent years, with more than 120 clinical studies demonstrating their therapeutic potential to date. Through the use of mRNA, it is possible to encode tumor-specific antigens and immunostimulatory molecules in order to activate the patient’s immune system, while maintaining a low dosage to reduce side effects and minimize drug resistance compared to conventional chemotherapy. However, the use of nucleic acids alone presents limitations: being rapidly degraded in vivo, their ability to reach target tissues before degradation is limited, their biodistribution is not targeted, and they face difficulties in crossing biological membranes. In this context, nanotechnology represents an advanced field offering promising solutions. Following the COVID-19 pandemic, their use has become even more widespread, especially in the development of innovative RNA-based therapies and vaccines. In particular, lipid nanoparticles (LNPs) are among the most effective systems for nucleic acid delivery, due to their high biocompatibility, encapsulation and release capacity, and the possibility of being engineered for specific targeting. In this thesis project, LNPs were synthesized containing mRNA encoding Green Fluorescent Protein (GFP), and subsequently functionalized with the monoclonal antibody Trastuzumab, in order to selectively direct them toward cells expressing a specific receptor, HER2+, characteristic of a clinically aggressive subtype of breast cancer. The nanoparticles were characterized by Dynamic Light Scattering (DLS) to determine their size and polydispersity index (PDI), thus confirming system stability and homogeneity. Additional analyses focused on encapsulation efficiency, long-term stability, and cytotoxicity to evaluate both the reliability and the safety of the system. The effectiveness of the functionalization was then evaluated through experiments in two-dimensional (2D) cell cultures, monitoring GFP expression as an indicator of cellular uptake. Finally, the project aims to assess cellular uptake in three-dimensional (3D) cultures (spheroids), to investigate the ability of nanoparticles to penetrate more complex structures, biomimetically closer to the in vivo tumor microenvironment. The results aim to investigate the effectiveness of LNP functionalization for targeted mRNA delivery in oncology, opening perspectives for the development of more effective and selective therapeutic systems.

L’uso di terapie basate su acidi nucleici negli ultimi anni sta aumentando notevolmente, con oltre 120 studi clinici che ad oggi ne dimostrano il potenziale terapeutico. Grazie all’uso di mRNA si riescono a codificare antigeni tumore-specifici e molecole immunostimolanti, in modo da attivare il sistema immunitario del paziente, mantenendo un dosaggio basso al fine di ridurre gli effetti collaterali e permettere una minor resistenza ai farmaci rispetto alla chemioterapia comune. Tuttavia l’utilizzo dei soli acidi nucleici presenta delle limitazioni, dal momento che sono sostanze biodegradabili la loro capacità di arrivare ai tessuti bersaglio prima di essere degradate è scarsa, inoltre la biodistribuzione non è mirata e mostrano difficoltà ad attraversare le membrane biologiche. A questo proposito, le nanotecnologie sono una scienza all’avanguardia che offre soluzioni interessanti, in particolare le nanoparticelle lipidiche (LNPs) rappresentano uno dei sistemi più promettenti per la veicolazione di acidi nucleici, grazie alla loro elevata biocompatibilità, capacità di incapsulamento e rilascio, e alla possibilità di essere ingegnerizzate per targeting specifici. In questo progetto di tesi sono state sintetizzate LNPs contenenti mRNA codificante per la proteina fluorescente verde (GFP), funzionalizzate poi con l’anticorpo monoclonale Trastuzumab, al fine di indirizzarle selettivamente verso quelle cellule che esprimono uno specifico recettore presente nei tessuti malati di cancro al seno. Le nanoparticelle ottenute sono state caratterizzate mediante Dynamic Light Scattering (DLS) per determinarne dimensione e indice di polidispersione (PDI), al fine di confermare la stabilità e l’omogeneità del sistema. Analisi aggiuntive si sono concentrate sull’efficienza di incapsulamento, la stabilità a lungo termine e la citotossicità, per valutarne l’affidabilità e la sicurezza. L’efficacia della funzionalizzazione è stata valutata attraverso esperimenti in colture cellulari bidimensionali, monitorando l’espressione della proteina GFP come indicatore dell’uptake cellulare. La fase finale del progetto prevede la valutazione dell’uptake cellulare in colture tridimensionali (sferoidi) per indagare la capacità delle LNPs di penetrare strutture più complesse e biomimeticamente più vicine al microambiente tumorale in vivo. I risultati ottenuti mirano a studiare l’efficacia della funzionalizzazione delle LNPs per la veicolazione mirata di mRNA in ambito oncologico, aprendo prospettive per lo sviluppo di sistemi terapeutici più efficaci e selettivi.