Morphological analysis of dendritic spines reveals synaptic alterations in Fragile X Syndrome derived brain organoids.

Fragile X Syndrome (FXS) is a leading inherited form of intellectual disability and autism spectrum disorders. A key neuropathological hallmark of FXS is the alteration of dendritic spine morphology, which reflects impaired synaptic development and plasticity. While several animal models have contributed to elucidating the cellular mechanisms underlying FXS, they do not fully capture human-specific neurodevelopmental dynamics. Human brain organoids represent an emerging in vitro system able to capture key architectural and developmental features of the human cortex. Dendritic spine morphology in FXS organoids has not been systematically investigated yet. This thesis aimed to determine whether FXS-derived brain organoids exhibit measurable alterations in dendritic spine morphology. To address this, a data-driven workflow was developed, integrating semi-automated morphometric extraction, dimensionality reduction, and clustering. A reference embedding was first trained on a literature-derived dataset, generating biologically interpretable spine groups that reflected known morphological continuum. This embedding was then used to project spines extracted from control and FXS organoids. FXS organoids showed a consistent enrichment in immature filopodia and thin spines, along with a reduction in mature mushroom spines. These alterations were evident at day 70 and maintained at day 90, when the increase in spine density also reached statistical significance. Control organoids displayed maturation over time, whereas FXS samples did not, indicating persistent developmental deficits. This work provides the first quantitative morphometric analysis of dendritic spines in FXS organoids and introduces a generalizable analytical framework that can be applied to the study of other neurological conditions characterized by spine dysregulation.

La sindrome dell’X fragile (FXS) rappresenta una delle principali forme ereditarie di disabilità intellettiva e disturbi dello spettro autistico. Un tratto neuropatologico caratteristico della FXS è l’alterazione della morfologia delle spine dendritiche, che riflette uno sviluppo sinaptico compromesso e una disfunzione della plasticità sinaptica. Sebbene numerosi modelli animali abbiano contribuito a chiarire i meccanismi cellulari alla base della patologia, essi non riescono a riprodurre pienamente le dinamiche del neurosviluppo specifiche dell’uomo. Gli organoidi cerebrali umani rappresentano un sistema in vitro emergente, capace di ricapitolare caratteristiche architetturali e fasi di sviluppo proprie della corteccia umana. Tuttavia, la morfologia delle spine dendritiche in organoidi FXS non è ancora stata studiata in modo sistematico. Questa tesi ha avuto l’obiettivo di determinare se gli organoidi cerebrali derivati da pazienti FXS presentino alterazioni misurabili nella morfologia delle spine dendritiche. A tale scopo è stato sviluppato un workflow data-driven che integra estrazione semi-automatica delle caratteristiche morfometriche, riduzione dimensionale e clustering. È stato innanzitutto addestrato un embedding di riferimento su un dataset derivato dalla letteratura, ottenendo gruppi di spine biologicamente interpretabili che rispecchiano il continuum morfologico noto. Questo embedding è stato successivamente utilizzato per proiettare le spine estratte da organoidi controllo e FXS. Gli organoidi FXS hanno mostrato un arricchimento consistente di spine immature, quali filopodia e thin spines, insieme ad una riduzione delle spine mature a morfologia “mushroom”. Tali alterazioni erano già evidenti al giorno 70 e si mantenevano al giorno 90, fase in cui anche l’aumento della densità delle spine raggiungeva significatività statistica. Nel tempo, gli organoidi controllo mostravano un chiaro percorso di maturazione, mentre quelli FXS no, indicando la presenza di deficit di sviluppo persistenti. Questo lavoro fornisce la prima analisi morfometrica quantitativa delle spine dendritiche in organoidi FXS ed introduce un framework analitico generalizzabile che può essere applicato allo studio di altre condizioni neurologiche caratterizzate da disregolazione delle spine.