Development and Application of a Microfluidic Chip for Drug Screening in a 3D Colorectal Cancer Model

Colorectal Cancer (CRC) is a neoplasm with high incidence and mortality, whose progression and therapeutic response are profoundly modulated by the heterogeneity and complexity of the tumor microenvironment. The growing need for innovative therapeutic agents requires predictive and translational in vitro models that can faithfully reflect the multiple and complex dynamics of the tumor environment. In this context, hydrogels derived from human decellularized Extracellular Matrix (dECM) offer a tissue-specific in vivo biomimetic substrate as conventional supports (Geltrex™), while retaining native biochemical and biomechanical properties of native tissue. In this context, the present thesis focused on the design and validation of a bi-layer microfluidic platform, capable of generating stable concentration gradients of biological molecules along the five cell culture-suitable chambers. The device was physically characterized and used for drug screening assays on human colorectal adenocarcinoma cells (HCT-116) cultured in 3D matrices of Geltrex™ and CologEM. The performance of the device was predicted using COMSOL Multiphysics® and validated with FITC dextrans at three different molecular weights (4, 70 and 500 kDa) and Doxorubicin, plotting their distribution to verify the gradient formation time and its temporal stability. Validation experiments were performed using both Geltrex™ and a dECM-derived hydrogel (CologEM). This analysis confirmed the ability of the chip to generate a stable gradient, highlighting that the stiffness of the matrix (quantified via AFM analysis) is a key factor influencing the dynamics of molecular diffusion. The device was then used for drug uptake and cytotoxicity screening assays on human colorectal adenocarcinoma cells (HCT-116) cultured inside Geltrex™. Cellular response assessment was conducted by exposing HCT-116 to 5 Fluorouracil (5-FU), the standard chemotherapy for CRC, using an initial concentration of 100 μM to generate the drug gradient during the 72 hours of treatment, aiming to overcome drug resistance induced by the 3D context. In conclusion, this model aims to determine the most suitable pharmacological conditions, fundamental for the future development of personalized and effective oncological therapies for CRC.

Il carcinoma colorettale (CRC) è una neoplasia ad alta incidenza e mortalità, la cui progressione e risposta terapeutica sono profondamente modulate dall'eterogeneità e dalla complessità del microambiente tumorale. La crescente necessità di agenti terapeutici innovativi richiede modelli in vitro predittivi e traslazionali in grado di riflettere fedelmente le molteplici e complesse dinamiche dell'ambiente tumorale. In questo contesto, gli idrogel derivati da matrice extracellulare decellularizzata umana (dECM) offrono un substrato biomimetico in vivo tessuto-specifico come supporti convenzionali (Geltrex™), pur mantenendo le proprietà biochimiche e biomeccaniche native del tessuto nativo. In questo contesto, la presente tesi si è concentrata sulla progettazione e la validazione di una piattaforma microfluidica a doppio strato, in grado di generare gradienti di concentrazione stabili di molecole biologiche lungo le cinque camere adatte alla coltura cellulare. Il dispositivo è stato fisicamente caratterizzato e utilizzato per saggi di screening farmacologico su cellule di adenocarcinoma colorettale umano (HCT-116) coltivate in matrici 3D di Geltrex™ e CologEM. Le previsioni del comportamento fluidodinamico del dispositivo sono state condotte utilizzando COMSOL Multiphysics®, e successivamente con dei destrani a tre diversi pesi molecolari (4, 70 e 500 kDa) coniugati con fluorofori (FITC) e Doxorubicina, tracciando la loro distribuzione per verificare il tempo di formazione del gradiente e la sua stabilità temporale. Tali validazioni sono state condotte utilizzando 2 diversi idrogel: Geltrex™ e un idrogel derivato da dECM (CologEM). Questa analisi ha confermato la capacità del chip di generare un gradiente stabile, evidenziando che la rigidità della matrice (quantificata tramite analisi AFM) è un fattore chiave che influenza la dinamica della diffusione molecolare. Il dispositivo, validato per il controllo del flusso, è stato successivamente utilizzato per l'assorbimento di farmaci e per saggi di screening di citotossicità su cellule di adenocarcinoma colorettale umano (HCT-116) coltivate all'interno di Geltrex™. La valutazione della risposta cellulare è stata condotta esponendo HCT 116 al 5-Fluorouracile (5-FU), la chemioterapia standard per il CRC, partendo da una concentrazione iniziale di 100 μM per generare il gradiente del farmaco durante le 72 ore di trattamento, con l'obiettivo di superare la resistenza ai farmaci indotta dal contesto 3D. In conclusione, questo modello si propone di determinare le condizioni farmacologiche più adatte, fondamentali per lo sviluppo futuro di terapie oncologiche personalizzate ed efficaci per il CRC.