Studio dei trasportatori del nitrato nelle microalghe del genere Nannochloropsis.

Microalgae are unicellular organisms that play an essential role in the marine ecosystem. They are primary producers at the base of food chains and introduce various nutrients, including carbon and nitrogen, into the biosphere. Furthermore, thanks to their photosynthetic processes, they are responsible for producing approximately 50% of the oxygen in the atmosphere. In these organisms, nitrogen metabolism and carbon metabolism are closely linked: nitrogen is a necessary component for the synthesis of amino acids, pigments, and proteins used in photosynthesis, which allows the uptake of ambient CO2 and the synthesis of carbon skeletons necessary for nitrogen assimilation processes. Nitrogen is present in low concentrations in the ocean and is absorbed by microalgae in various forms, such as ammonium, nitrate, or urea. Nitrate, the most common nitrogen source in the ocean, is taken up by cells via membrane transporters called NRTs, after which it is reduced to nitrite and finally to ammonium and used in the synthesis of amino acids. This study focused on the microalgae Nannochloropsis oceanica, which is of great environmental and biotechnological interest due to its ability to accumulate triacylglycerols, which can be used for biodiesel production, and other high-value metabolites such as carotenoids and omega-3 fatty acids. This makes research on this genus of microalgae extremely relevant, as they could be used as a sustainable source of lipids and proteins. N. oceanica possesses only two NRT transporters, designated NRT2.1 and NRT2.2, which were the primary focus of the study. To determine whether different levels of environmental nitrate affect the growth rate of N. oceanica, growth quantification was performed at different nitrate concentrations, comparing it with the growth of another alga of the same genus, N. gaditana. Experiments showed that the growth rate of both species decreased significantly in nitrate-poor environments, confirming the importance of this nutrient in Nannochloropsis nitrogen metabolism. Subsequently, knockout strains of the two transporters NRT2.1 and NRT2.2 were isolated using CRISPR-Cas12a. Growth experiments showed that the nrt2.1 mutant strains grew at a comparable rate to the WT, while the nrt2.2 mutant strains exhibited significant growth defects compared to the WT when grown under nitrogen deprivation. WT, nrt2.1, and nrt2.2 knock-outs grow similarly in the presence of ammonium, indicating that the NRT2.2 transporter plays a central role in growth under environmental nitrate-deficient conditions. Infine è stato costruito un plasmide contenente la sequenza genica di NRT2.2 fusa alla sequenza codificante per la proteina fluorescente Venus per studi di localizzazione del trasportatore del nitrato in N. oceanica.

Le microalghe sono organismi unicellulari che hanno un ruolo essenziale all’interno dell’ecosistema marino. Sono produttori primari alla base delle catene trofiche e introducono nella biosfera vari nutrienti, tra cui carbonio ed azoto. Inoltre, grazie ai loro processi fotosintetici, sono responsabili della produzione di circa il 50% dell’ossigeno presente in atmosfera. In questi organismi il metabolismo dell’azoto e il metabolismo del carbonio sono strettamente collegati: l’azoto è un componente necessario per la sintesi di amminoacidi, pigmenti e proteine usate nella fotosintesi, che permette l’assunzione di CO2 ambientale e la sintesi di scheletri carboniosi necessari ai processi di assimilazione dell’azoto. L’azoto è presente in basse concentrazioni all’interno dell’oceano ed è assorbito dalle microalghe in varie forme come ad esempio ammonio, nitrato o urea. Il nitrato, la fonte di azoto più comune nell’oceano, è assunto dalla cellula mediante trasportatori di membrana chiamati NRT, dopodiché viene ridotto a nitrito e infine ad ammonio e usato nella sintesi di amminoacidi. Questo studio si è focalizzato sulla microalga Nannochloropsis oceanica, la quale ha un grande interesse dal punto di vista ambientale e biotecnologico per la sua capacità di accumulare triacilgliceroli, utilizzabili per la produzione di biodiesel, e altri metaboliti ad alto valore aggiunto come carotenoidi e omega-3. Ciò rende la ricerca su questo genere di microalghe estremamente rilevante, poiché potrebbero essere usate come una fonte sostenibile di lipidi e proteine. N. oceanica possiede esclusivamente due trasportatori NRT, denominati NRT2.1 ed NRT2.2, che sono stati il soggetto principale dello studio. Per sapere se differenti livelli di nitrato ambientale possono avere un effetto sul tasso di crescita di N. oceanica, sono state effettuate quantificazioni della crescita in diverse concentrazioni di nitrato, confrontandola con la crescita di un'altra alga dello stesso genere, N. gaditana. Gli esperimenti evidenziano come il tasso di crescita di entrambe le specie cali significativamente in ambienti poveri di nitrato, confermando l’importanza di questo nutriente nel metabolismo dell’azoto di Nannochloropsis. Successivamente, mediante CRISPR-Cas12a, sono stati isolati ceppi knock-out dei due trasportatori NRT2.1 ed NRT2.2. Esperimenti di crescita hanno evidenziato come i ceppi mutati nrt2.1 crescano in modo comparabile al WT mentre i ceppi mutanti nrt2.2 abbiano importanti difetti di crescita rispetto al WT, se coltivati in carenza d’azoto. WT, nrt2.1 e nrt2.2 knock-out crescono in modo simile in presenza di ammonio, indicando che il trasportatore NRT2.2 ha un ruolo centrale nella crescita in condizioni carenti di nitrato ambientale. Infine è stato costruito un plasmide contenente la sequenza genica di NRT2.2 fusa alla sequenza codificante per la proteina fluorescente Venus per studi di localizzazione del trasportatore del nitrato in N. oceanica.