Studi in vitro su cellule di osteosarcoma MG63: differenze del fenotipo mitocondriale nella resistenza alla doxorubicina

Doxorubicin is a chemotherapy drug used to treat several solid tumors including osteosarcoma. Despite the proven clinical efficacy of this drug, its use remains problematic both due to the severity of the side effects and the onset of resistance. Resistance to doxorubicin is a multifactorial event for which various molecular mechanisms have been proposed such as the inefficient administration and / or penetration of the drug, the reduced inflow of drugs due to alterations in drug transporters, the increase in drug efflux due to the regulation of ATP-binding cassette (ABC) transporters, the increase in antioxidant systems, the reduced affinity of the drug with its target due to overexpression, reduced expression or presence of mutations of the target at the site of interaction, the reduced accumulation due to to intracellular modifications of drugs, perturbations in apoptosis and in cell cycle regulation, alterations in DNA repair pathways, altered signal transduction, the influence of the tumor microenvironment. However, metabolic reprogramming also plays an important role in tumor resistance. Several studies have shown that doxorubicin can interact not only with nuclear DNA (nDNA), but also with mitochondrial DNA (mtDNA). In this project we evaluated the mitochondrial phenotype of the MG63 cell line, isolated from human osteosarcoma and of the doxorubicin (DXR) -resistant variants MG63 DXR 30 ng/mL and MG63 DXR 100 ng/mL. What could be noted was a reduction in mitochondrial potential probably due to a metabolic shift towards aerobic glycolysis, to a reduced use of oxidative phosphorylation and consequently to a reduced transfer of protons to the inter-membrane. Furthermore, damage to mtDNA can also cause dysfunctions at the level of the mitochondrial respiratory chain with reduction of the expression of the ETC complexes and possible reduction of the functionality of the complexes. Damage to mtDNA can also lead to a reduction in potential due to the depletion of NAD+ and ATP used by repair systems to fix the damage. A decrease in mitochondral mass was then observed with the use of the NAO probe and with the protein expression of TOM20 and VDAC1. This decrease can be caused by imbalances in the processes of mitochondrial biogenesis and mitophagy. Reduced cell viability was also found following rotenone-induced metabolic stress. This may be caused by increased ROS production following inhibition of ETC Complex I resulting in oxidative damage. A reduction in cell viability was also observed following metabolic stress induced by glucose deprivation and treatment with galactose. Galactose is metabolized slowly through the glycolytic pathway, forcing cells to use oxidative phosphorylation for ATP production. The reduction of vitality may be associated with the dependence of cells on glycolysis (aerobic glycolysis, Warburg effect). Finally, a reduction in the presence of ROS was highlighted in the lines resistant to doxorubicin. This can be explained by assuming that there is an increase in the expression levels of antioxidant systems, both of the non-enzymatic type as glutathione and of the enzymatic type such as superoxide dismutase or catalase.

La doxorubicina è un farmaco chemioterapico impiegato per il trattamento di diversi tumori solidi tra cui l’osteosarcoma. Nonostante la comprovata efficacia clinica di questo farmaco, il suo utilizzo rimane problematico sia per la severità degli effetti collaterali che per l'insorgenza del fenomeno della resistenza. La resistenza alla doxorubicina è un evento multifattoriale per cui sono stati proposti diversi meccanismi molecolari quali l’inefficiente somministrazione e/o penetrazione del farmaco, il ridotto afflusso di farmaci dovuto ad alterazioni dei trasportatori di farmaci, l’aumento dell'efflusso di farmaci dovuto alla sovraregolazione dei trasportatori ATP-binding cassette (ABC), l’aumento dei sistemi antiossidanti, la ridotta affinità del farmaco con il suo bersaglio a causa della sovraespressione, ridotta espressione o della presenza di mutazioni del bersaglio nel sito di interazione, il ridotto accumulo dovuto a modificazioni intracellulari di farmaci, le perturbazioni nell'apoptosi e nella regolazione del ciclo cellulare, le alterazioni nei percorsi di riparazione del DNA, la trasduzione del segnale alterata, l’influenza del microambiente tumorale. Nella resistenza gioca però un ruolo importante anche la riprogrammazione metabolica. Diversi studi hanno dimostrato che la doxorubicina può interagire non solo con il DNA nucleare (nDNA), ma anche con il DNA mitocondriale (mtDNA). In questo progetto è stato valutato il fenotipo mitocondriale della linea cellulare MG63, isolata da osteosarcoma umano e delle varianti doxorubicina (DXR)-resistenti MG63 DXR 30 ng/mL e MG63 DXR 100 ng/mL. Quello che si è potuto notare è stato una diminuzione del potenziale mitocondriale dovuto probabimente ad uno shift metabolico verso la glicolisi aerobica, ad un ridotto utilizzo della fosforilazione ossidativa e conseguentemente ad un ridotto trasferimento di protoni nello spazio intermembrana. Inoltre, anche il danneggiamento del mtDNA può causare disfunzioni a livello della catena respiratoria mitocondriale con riduzione dell’espressione dei complessi dell’ETC e possibile riduzione della funzionalità dei complessi. Il danneggiamento del mtDNA può anche portare ad una riduzione del potenziale a causa dell’esaurimento di NAD+ e ATP utilizzati dai sistemi di riparazione per aggiustare il danno. È stato poi osservata una diminuzione della massa mitocondriale mediante l’utilizzo di sonda NAO e la valutazione dell’espressione proteica di TOM20 e VDAC1. Questa diminuzione può essere causata da sbilanciamenti nei processi di biogenesi mitocondriale e mitofagia. È stata poi evidenziata una diminuzione della vitalità cellulare in seguito a stress metabolico indotto da rotenone. Questo può essere causato da un’aumentata produzione di ROS in seguito all’inibizione del Complesso I dell’ETC con conseguente danno ossidativo. Si è osservato anche una diminuzione della vitalità cellulare in seguito a stress metabolico indotto da deprivazione di glucosio e trattamento con galattosio. Il galattosio viene metabolizzato lentamente attraverso la via glicolitica forzando le cellule ad utilizzare la fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP. La riduzione di vitalià può essere associata alla dipendenza delle cellule dalla glicolisi (glicolisi aerobica, effetto Warburg). Infine è stata evidenziata una riduzione della presenza di ROS a livello delle linee resistenti alla doxorubicina. Questo può essere spiegato ipotizzando che vi sia un aumento dei livelli di espressione dei sistemi antiossidanti, sia di tipo non enzimatico come il glutatione, sia di tipo enzimatico come la superossido dismutasi o la catalasi.