Sviluppo di metodi di spettrometria di massa per l'identificazione e quantificazione di modifiche ossidative pro-trombotiche del fattore di von Willebrand in pazienti con Sindrome Antifosfolipidica

L’APS (Sindrome Antifosfolipidica) è una patologia autoimmune caratterizzata dalla presenza di autoanticorpi antifosfolipidi (aPL) i quali sono responsabili dello sviluppo a livello clinico di episodi ricorrenti di trombosi, trombocitopenia e aborti spontanei. Gli aPL promuovono elevati livelli di stress ossidativo, lo sviluppo di uno stato infiammatorio e l’alterazione dell’endotelio vascolare che inducono un effetto pro-infiammatorio e pro-coagulante. Allo stesso tempo, rispetto ad un soggetto clinicamente sano i pazienti affetti da APS presentano livelli aumentati di multimeri ad alto peso molecolare di una proteina plasmatica, il fattore di vonWillebrand (von Willebrand Factor, vWF). Il vWF è una glicoproteina (∼240 kDa) rilasciata nel plasma sotto forma di UL-vWF (Ultra Large-vWF, oligomeri di vWF ad alto peso molecolare, fino a 50000 kDa) dalle cellule dell’endotelio vascolare e dai megacariociti, ed è responsabile dell’avvio dell’emostasi primaria. Il potenziale pro-emostatico del vWF aumenta all’aumentare del suo peso molecolare, e quindi del suo stato di oligomerizzazione, che è regolato proteoliticamente dall’ADAMTS13, una zinco-proteasi in grado di proteolizzare il vWF a livello del legame peptidico Tyr1605-Met1606. Precedenti studi hanno dimostrato che l’ossidazione in vitro della Met1606 ostacola il taglio dei multimeri ad opera dell’ADAMTS-13, portando all’accumulo di UL-vWF dotato di maggior potenziale protrombotico. A causa di questa condizione, i pazienti affetti da APS presentano un rischio aumentato di sviluppare complicanze cardiovascolari, i cui meccanismi sottostanti sono perlopiù sconosciuti. Nel presente Elaborato di Tesi sono state condotte delle analisi per dimostrare in prima istanza l’effettiva correlazione tra elevati livelli di stress ossidativo nei pazienti in esame e la presenza di maggiori concentrazioni di UL-vWF, comparando soggetti clinicamente sani e soggetti affetti da APS. Successivamente è stato sviluppato un metodo che permettesse di eseguire analisi in microscala per la caratterizzazione chimica dello stato ossidativo della metionina 1606, con il fine ultimo di sviluppare un test prognostico/diagnostico in grado di valutare il rischio di sviluppo di eventi trombotici nei pazienti di APS . Questo risulta essere il passaggio più critico in quanto questa proteina si trova nel plasma in concentrazioni estremamente basse (10 µg/mL) e, a differenza di studi disponibili in letteratura, si è cercato di analizzare il vWF su volumi di plasma molto ridotti, passando da un minimo di 10 mL a 1 mL o meno. Utilizzando le tecniche di TMS (Targeted Mass Spectrometry), è stato possibile rilevare la presenza di vWF nei campioni di plasma trattati partendo da volumi inferiori ad 1 mL, identificando inoltre il frammento prototipico contenente la metionina 1606 in forma ridotta. I segnali ottenuti mediante spettrometria di massa corrispondenti al peptide contenente la metionina ossidata, tuttavia, sono stati rilevati ma non è stato possibile quantificarli e ulteriori esperimenti saranno necessari per sviluppare ulteriormente il metodo.