Ca2+ signalling regulates a variety of cellular functions, from the origin of new life to cell death. Due to its importance, cells have developed different mechanisms to finely regulate Ca2+ signals, including a specific Ca2+ signalling toolkit and a spatio-temporal regulatory mechanism. One of the most important spatial regulatory mechanisms in the cells is the formation of microdomains of high Ca2+ concentration, defined by the interaction of the endoplasmic reticulum (ER) with mitochondria, called Mitochondria-Associated Membranes (MAMs). MAMs are formed by regions of the ER membrane physically and biochemically connected with the mitochondrion. The close proximity between mitochondria and ER, which is the main intracellular Ca2+ store, allows for direct and selective transport of Ca2+ between the two organelles. Ca2+ homeostasis is important for the functionality and the survival of all the cells, including neurons. Alterations in Ca2+ homeostasis have been associated with the appearance and progression of neurodegenerative diseases, leading to the postulation of a pathogenic hypothesis for Alzheimer’s disease (AD) involving Ca2+ signalling dysregulation. AD is an irreversible neurodegenerative disease and is the most common cause of dementia. Most cases occur in the sporadic form (SAD), but a small percentage (2%) is represented by the hereditary familial form (FAD). Mutations in the genes that encode the Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin-1 (PS1) and Presenilin-2 (PS2) are responsible for FAD, negatively affecting the formation process of the Aβ peptide leading to its accumulation in neurons, which is toxic, causing neurodegeneration the onset of the disease. Data from our lab have shown that PS2 plays a fundamental role in the modulation of the tethering between ER and mitochondria, as well as in the Ca2+ transfer between the two organelles. PS2 interacts with Mitofusin-2 (Mfn2), a protein in the MAMs that regulates the cross-talk between ER and mitochondria, preventing the excessive coupling between the two organelles. PS2 acts as an antagonist of Mfn2 and causes an increase in ER-mitochondria tethering. In particular, the mutated forms of PS2 associated with FAD (FAD-PS2) show a greater effect than PS2 WT. In addition, PS2 WT and especially FAD-PS2 reduce the ER Ca2+ concentration and increase the efficiency of ER-mitochondria Ca2+ transfer. Based on these evidence, we decided to evaluate whether the presence of FAD-PS2 would alter the interaction of Mfn2 with other proteins. The latter were identified through immunoprecipitation, and among the different interactors, we focused on ATAD3A, as data in the literature suggest its involvement in the ER-mitochondria coupling. We performed experiments in a mouse hippocampal cell line (HT22), to evaluate whether, by silencing ATAD3A, caused an alteration in the Ca2+ transfer between ER and mitochondria. To understand if ATAD3A had a role in the communication between ER and mitochondria rather than in the efficiency of mitochondrial Ca2+ uptake, further experiments were carried out, which allowed us to discard the second hypothesis. Therefore, it can be speculated that the functional alteration observed upon ATAD3A silencing is due to an involvement of the protein in the modulation of the structural coupling between ER and mitochondria.

Il segnale Ca2+ controlla una varietà di funzioni cellulari, dall’origine di nuova vita alla morte cellulare. Per la sua importanza, le cellule hanno sviluppato diversi meccanismi per regolare finemente questo segnale, incluso un meccanismo di regolazione spazio-temporale. Uno dei più importanti meccanismi cellulari di regolazione spaziale del segnale Ca2+ è rappresentato dalla creazione di microdomini ad elevata concentrazione del segnale, definiti dall’interazione del reticolo endoplasmatico (ER) con i mitocondri, chiamati Membrane Associate ai Mitocondri (MAM). Le MAM sono formate da regioni della membrana dell’ER connesse fisicamente e funzionalmente con il mitocondrio. La stretta vicinanza tra mitocondri ed ER, che è il principale deposito intracellulare di Ca2+, consente il trasporto diretto e selettivo dello ione Ca2+ tra i due organelli. L’omeostasi del Ca2+ è importante per la funzionalità e la sopravvivenza delle cellule, inclusi i neuroni. Alterazioni nell’omeostasi del Ca2+ sono state associate all’insorgenza e alla progressione di malattie neurodegenerative, e hanno portato alla formulazione di un’ipotesi patogenetica per la malattia di Alzheimer (AD) che coinvolge la deregolazione cellulare del segnale Ca2+. L’AD è una malattia neurodegenerativa irreversibile ed è la causa di demenza più comune. La maggior parte dei casi si presenta nella forma sporadica (SAD), ma una piccola percentuale (2%) è rappresentata dalla forma familiare ereditaria (FAD). Mutazioni nei geni che codificano per la Proteina Precursore dell’Amiloide (APP), Presenilina-1 (PS1) e Presenilina-2 (PS2) determinano la comparsa di FAD, influenzando negativamente il processo di formazione del peptide Aβ e portando ad un suo accumulo nei neuroni, che risulta tossico, determinando neurodegenerazione e l’insorgenza della malattia. Dati ottenuti dal nostro laboratorio hanno evidenziato che PS2 ha un ruolo fondamentale nella modulazione dell’accoppiamento tra ER e mitocondri, così come nel trasporto di Ca2+ tra i due organelli. PS2 interagisce con Mitofusina-2 (Mfn2), una proteina che si trova a livello delle MAM e regola l’interazione tra ER e mitocondri, impedendo un eccessivo accoppiamento dei due organelli. PS2 agisce come antagonista di Mfn2 e provoca quindi un aumento dell’associazione tra ER e mitocondri. In particolare, le forme mutate di PS2 associate a FAD (FAD-PS2) hanno un effetto maggiore rispetto alla forma di PS2 WT. Inoltre, PS2 WT e soprattutto FAD-PS2 riducono il contenuto di Ca2+ nell’ER e aumentano l’efficienza di trasferimento dello ione tra ER e mitocondri. Sulla base di queste evidenze, abbiamo deciso di valutare se la presenza di FAD-PS2 alterasse l’interazione di Mfn2 con altre proteine. Queste ultime sono state identificate tramite immunoprecipitazione, e tra i diversi interattori ci siamo focalizzati su ATAD3A, in quanto dati presenti in letteratura suggeriscono un suo coinvolgimento nell’accoppiamento tra ER e mitocondri. Abbiamo condotto esperimenti in una linea cellulare di neuroni ippocampali murini immortalizzati (HT22), per valutare se, silenziando ATAD3A, ci fosse un’alterazione nel trasporto di Ca2+ tra ER e mitocondri. I nostri risultati mostrano un aumento del trasferimento di Ca2+ tra i due organelli nelle cellule in cui l’espressione di ATAD3A è stata ridotta (ATAD3A-KD), che potrebbe essere dovuto ad un’alterazione del loro accoppiamento. Per cercare di capire se ATAD3A avesse un ruolo nella comunicazione tra ER e mitocondri piuttosto che nell’efficienza di uptake di Ca2+ da parte dei mitocondri, sono stati condotti ulteriori esperimenti che hanno permesso di scartare la seconda ipotesi. Si può quindi ipotizzare che l’alterazione funzionale osservata sia dovuta ad un coinvolgimento di ATAD3A nella modulazione dell’interazione strutturale tra ER e mitocondri.

Ruolo di ATAD3A nella modulazione dell'accoppiamento tra reticolo endoplasmatico e mitocondri

DE PASCALIS, MARTINA
2021/2022

Abstract

Ca2+ signalling regulates a variety of cellular functions, from the origin of new life to cell death. Due to its importance, cells have developed different mechanisms to finely regulate Ca2+ signals, including a specific Ca2+ signalling toolkit and a spatio-temporal regulatory mechanism. One of the most important spatial regulatory mechanisms in the cells is the formation of microdomains of high Ca2+ concentration, defined by the interaction of the endoplasmic reticulum (ER) with mitochondria, called Mitochondria-Associated Membranes (MAMs). MAMs are formed by regions of the ER membrane physically and biochemically connected with the mitochondrion. The close proximity between mitochondria and ER, which is the main intracellular Ca2+ store, allows for direct and selective transport of Ca2+ between the two organelles. Ca2+ homeostasis is important for the functionality and the survival of all the cells, including neurons. Alterations in Ca2+ homeostasis have been associated with the appearance and progression of neurodegenerative diseases, leading to the postulation of a pathogenic hypothesis for Alzheimer’s disease (AD) involving Ca2+ signalling dysregulation. AD is an irreversible neurodegenerative disease and is the most common cause of dementia. Most cases occur in the sporadic form (SAD), but a small percentage (2%) is represented by the hereditary familial form (FAD). Mutations in the genes that encode the Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin-1 (PS1) and Presenilin-2 (PS2) are responsible for FAD, negatively affecting the formation process of the Aβ peptide leading to its accumulation in neurons, which is toxic, causing neurodegeneration the onset of the disease. Data from our lab have shown that PS2 plays a fundamental role in the modulation of the tethering between ER and mitochondria, as well as in the Ca2+ transfer between the two organelles. PS2 interacts with Mitofusin-2 (Mfn2), a protein in the MAMs that regulates the cross-talk between ER and mitochondria, preventing the excessive coupling between the two organelles. PS2 acts as an antagonist of Mfn2 and causes an increase in ER-mitochondria tethering. In particular, the mutated forms of PS2 associated with FAD (FAD-PS2) show a greater effect than PS2 WT. In addition, PS2 WT and especially FAD-PS2 reduce the ER Ca2+ concentration and increase the efficiency of ER-mitochondria Ca2+ transfer. Based on these evidence, we decided to evaluate whether the presence of FAD-PS2 would alter the interaction of Mfn2 with other proteins. The latter were identified through immunoprecipitation, and among the different interactors, we focused on ATAD3A, as data in the literature suggest its involvement in the ER-mitochondria coupling. We performed experiments in a mouse hippocampal cell line (HT22), to evaluate whether, by silencing ATAD3A, caused an alteration in the Ca2+ transfer between ER and mitochondria. To understand if ATAD3A had a role in the communication between ER and mitochondria rather than in the efficiency of mitochondrial Ca2+ uptake, further experiments were carried out, which allowed us to discard the second hypothesis. Therefore, it can be speculated that the functional alteration observed upon ATAD3A silencing is due to an involvement of the protein in the modulation of the structural coupling between ER and mitochondria.
2021
Role of ATAD3A in the modulation of the cross-talk between endoplasmic reticulum and mitochondria
Il segnale Ca2+ controlla una varietà di funzioni cellulari, dall’origine di nuova vita alla morte cellulare. Per la sua importanza, le cellule hanno sviluppato diversi meccanismi per regolare finemente questo segnale, incluso un meccanismo di regolazione spazio-temporale. Uno dei più importanti meccanismi cellulari di regolazione spaziale del segnale Ca2+ è rappresentato dalla creazione di microdomini ad elevata concentrazione del segnale, definiti dall’interazione del reticolo endoplasmatico (ER) con i mitocondri, chiamati Membrane Associate ai Mitocondri (MAM). Le MAM sono formate da regioni della membrana dell’ER connesse fisicamente e funzionalmente con il mitocondrio. La stretta vicinanza tra mitocondri ed ER, che è il principale deposito intracellulare di Ca2+, consente il trasporto diretto e selettivo dello ione Ca2+ tra i due organelli. L’omeostasi del Ca2+ è importante per la funzionalità e la sopravvivenza delle cellule, inclusi i neuroni. Alterazioni nell’omeostasi del Ca2+ sono state associate all’insorgenza e alla progressione di malattie neurodegenerative, e hanno portato alla formulazione di un’ipotesi patogenetica per la malattia di Alzheimer (AD) che coinvolge la deregolazione cellulare del segnale Ca2+. L’AD è una malattia neurodegenerativa irreversibile ed è la causa di demenza più comune. La maggior parte dei casi si presenta nella forma sporadica (SAD), ma una piccola percentuale (2%) è rappresentata dalla forma familiare ereditaria (FAD). Mutazioni nei geni che codificano per la Proteina Precursore dell’Amiloide (APP), Presenilina-1 (PS1) e Presenilina-2 (PS2) determinano la comparsa di FAD, influenzando negativamente il processo di formazione del peptide Aβ e portando ad un suo accumulo nei neuroni, che risulta tossico, determinando neurodegenerazione e l’insorgenza della malattia. Dati ottenuti dal nostro laboratorio hanno evidenziato che PS2 ha un ruolo fondamentale nella modulazione dell’accoppiamento tra ER e mitocondri, così come nel trasporto di Ca2+ tra i due organelli. PS2 interagisce con Mitofusina-2 (Mfn2), una proteina che si trova a livello delle MAM e regola l’interazione tra ER e mitocondri, impedendo un eccessivo accoppiamento dei due organelli. PS2 agisce come antagonista di Mfn2 e provoca quindi un aumento dell’associazione tra ER e mitocondri. In particolare, le forme mutate di PS2 associate a FAD (FAD-PS2) hanno un effetto maggiore rispetto alla forma di PS2 WT. Inoltre, PS2 WT e soprattutto FAD-PS2 riducono il contenuto di Ca2+ nell’ER e aumentano l’efficienza di trasferimento dello ione tra ER e mitocondri. Sulla base di queste evidenze, abbiamo deciso di valutare se la presenza di FAD-PS2 alterasse l’interazione di Mfn2 con altre proteine. Queste ultime sono state identificate tramite immunoprecipitazione, e tra i diversi interattori ci siamo focalizzati su ATAD3A, in quanto dati presenti in letteratura suggeriscono un suo coinvolgimento nell’accoppiamento tra ER e mitocondri. Abbiamo condotto esperimenti in una linea cellulare di neuroni ippocampali murini immortalizzati (HT22), per valutare se, silenziando ATAD3A, ci fosse un’alterazione nel trasporto di Ca2+ tra ER e mitocondri. I nostri risultati mostrano un aumento del trasferimento di Ca2+ tra i due organelli nelle cellule in cui l’espressione di ATAD3A è stata ridotta (ATAD3A-KD), che potrebbe essere dovuto ad un’alterazione del loro accoppiamento. Per cercare di capire se ATAD3A avesse un ruolo nella comunicazione tra ER e mitocondri piuttosto che nell’efficienza di uptake di Ca2+ da parte dei mitocondri, sono stati condotti ulteriori esperimenti che hanno permesso di scartare la seconda ipotesi. Si può quindi ipotizzare che l’alterazione funzionale osservata sia dovuta ad un coinvolgimento di ATAD3A nella modulazione dell’interazione strutturale tra ER e mitocondri.
Calcio
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Mitocondri
Equorina
Neurodegenerazione
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