Ottimizzazione e validazione di un metodo per la rilevazione di virus influenzali aviari H5 ad alta patogenicità basato sul sistema CRISPR–Cas12

Avian influenza viruses (AIV), particularly highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 subtypes, represent a major threat to the poultry industry and public health due to their zoonotic potential. Among these HPAI strains, many of which originate from low pathogenic precursors (LPAI), the A/Goose/Guangdong/1/96 (Gs/Gd) lineage is one of the main contributors to epidemics characterized by high mortality rates in poultry. Rapid and accurate diagnosis is therefore essential for the effective control and management of outbreaks. Conventional diagnostic methods, such as viral isolation, are time-consuming and require laboratories with high biosafety levels (BSL-3). Molecular techniques are currently the methods of choice due to their speed, sensitivity, and specificity. The gold standard for identifying avian influenza strains remains RT-PCR targeting a segment of the HA gene, followed by Sanger sequencing for pathotyping; however, this approach is costly and requires highly specialized personnel. To complement and support current diagnostic practices, this thesis project focused on the optimization and validation of a novel diagnostic method based on the CRISPR–Cas12 system, designed for the detection and pathotyping of H5 avian influenza viruses. Furthermore, in this study, the CRISPR–Cas12 technology was coupled with an isothermal amplification system to develop a Point-of-Care (POC) tool for the rapid and specific detection of H5 HPAI viruses in field diagnostic settings. Thus, we developed a diagnostic assay that is sensitive, specific, and potentially applicable in field surveillance contexts, thereby enhancing the timeliness of response to health emergencies.

I virus dell’influenza aviaria (AIV), in particolare i ceppi ad alta patogenicità (Highly Pathogenic Avian Influenza-HPAI) del sottotipo H5, costituiscono una minaccia significativa per l’industria avicola e per la salute pubblica a causa del loro potenziale zoonotico. Tra questi ceppi HPAI, dei quali molti derivano da precursori a bassa patogenicità (LPAI), il lineage A/Goose/Guangdong/1/96 (Gs/Gd) è uno dei principali responsabili di epidemie con elevati tassi di mortalità nel pollame. La diagnosi rapida e accurata è quindi essenziale per il controllo e la gestione dei focolai. I metodi diagnostici convenzionali, come l'isolamento virale, sono lenti e richiedono laboratori con elevati livelli di biosicurezza (BSL-3). Le tecniche molecolari sono oggi il metodo di elezione per la loro elevata rapidità di esecuzione, sensibilità e specificità. Il gold standard per l’identificazione dei ceppi influenzali aviari rimane la RT-PCR di un segmento del gene HA seguita da sequenziamento Sanger per patotipizzare, il quale però è una tecnologia molto costosa e che richiede personale altamente specializzato. Allo scopo di integrare e supportare la corrente pratica diagnostica, il presente progetto di tesi si è incentrato sull’ottimizzazione e la validazione di un nuovo metodo diagnostico basato sul sistema CRISPR/Cas12 finalizzato alla rilevazione e patotipizzazione di virus influenzali aviari H5. Inoltre, in questo progetto di tesi questa tecnologia CRISPR/Cas12 è stata accoppiata ad un sistema di amplificazione isotermica per sviluppare uno strumento Point-of-Care (POC) per la rilevazione rapida e specifica di virus H5 HPAI in un contesto di diagnostica sul campo. Dunque, abbiamo sviluppato un test diagnostico sensibile, specifico e potenzialmente utilizzabile in contesti di sorveglianza sul campo, migliorando così la prontezza di risposta alle emergenze sanitarie.