Sviluppo di biosensori fluorescenti per monitorare le dinamiche del calcio a livello lisosomiale

Lo ione calcio (Ca2+) è un catione bivalente essenziale per la vitalità cellulare. Esso è un secondo messaggero universale che funge da segnale per l’innesco di numerosi processi fisiologici. Il profilo di concentrazione del Ca²⁺ è dinamico e compartimento-specifico all’interno della cellula. In questo contesto, anche i lisosomi svolgono un importante ruolo di riserva di questo ione. A differenza di altri compartimenti subcellulari, in cui il monitoraggio della concentrazione di Ca²⁺ è generalmente semplice e ben consolidato, la rilevazione di questo ione all’interno dei lisosomi risulta più complessa a causa dei bassi valori di pH (4.5–5.5). La maggior parte dei Genetically-encoded Calcium Indicators (GECIs), indicatori Ca2+ basati su proteine, risultano infatti poco fluorescenti in questi ambienti a causa del fenomeno del quenching del fluoroforo. Tuttavia, alcuni GECIs basati su proteine fluorescenti blu (BFP) sembrano funzionare anche in ambienti moderatamente acidi, almeno in vitro. Abbiamo quindi deciso di sviluppare dei GECIs per monitorare le variazioni intraluminali di Ca2+ nei lisosomi. Siamo partiti da un sensore chiamato XCaMP-B, introducendo delle mutazioni per diminuirne l’affinità. Per quanto riguarda le strategie di targeting, abbiamo sfruttato due proteine della membrana lisosomiale, LAMP1 e VAMP7. L’inserimento di un ulteriore fluoroforo, mScarlet, dovrebbe permettere di normalizzare il segnale in relazione ai diversi livelli di espressione del biosensore. Questo approccio può fornire un nuovo strumento di analisi in vitro delle dinamiche del calcio a livello dei lisosomi, aprendo nuove prospettive per chiarire il loro ruolo nella segnalazione cellulare.