Valutazione preliminare del potenziale ruolo di KCNH1 nell’interazione vimentina-Gquadruplex

In recent years, increasing interest has emerged in G-quadruplexes (G4s) as potential therapeutic targets in oncology. These non-canonical secondary DNA structures, which form within guanine-rich sequences, have been shown to participate in numerous biological processes and to be involved in tumour progression. The formation and stability of G4s are strongly influenced by intracellular factors, particularly the concentration of monovalent cations such as potassium. In parallel, recent evidence suggests that vimentin, a marker of epithelial-mesenchymal transition (EMT) and a protein historically considered a cytoskeletal component, is also capable of interacting with G4 structures at the nuclear level. Within the framework of this thesis project, and with the overall aim of determining whether the presence of vimentin in the nucleus is influenced by the stability and abundance of G4 structures, a knockdown of KCNH1 (potassium voltage-gated channel subfamily H member 1) was performed. This gene encodes the voltage-gated potassium channel hEAG1, which has previously been reported to modulate intracellular potassium concentration and, consequently, to influence the formation and stability of nuclear G4 structures. The objective of this study was to evaluate whether the reduction of KCNH1 expression could increase the number of nuclear G4s and whether such variation might be associated with the presence of vimentin in the nucleus. Based on preliminary data on KCNH1 expression in several human breast cancer cell lines obtained by real-time quantitative PCR (qPCR), the BT549 cell line was selected as the in vitro model. The knockdown of the transporter was optimized by testing different transfection conditions to identify a balance between silencing efficiency and cytotoxicity. The efficiency of gene silencing was assessed by analysing gene expression levels through qPCR. An efficient knockdown of KCNH1 was achieved. In contrast, no differences in vimentin expression were observed between cells treated with KCNH1-specific siRNA and control cells. Subsequently, the nuclear distribution of G4 structures was evaluated by immunofluorescence, using different antibodies specific for these structures. The analysis of the results highlighted several critical issues, particularly those related to the specificity of the antibodies used for the detection of these non-canonical structures. This thesis project should be considered as a preliminary study that requires further validation through the quantification of the proteins encoded by KCNH1 and VIM, to evaluate the expression of the voltage-gated potassium channel Eag1, and to confirm the nuclear translocation of vimentin. Therefore, further investigations will be required to optimize the visualization of G4 structures. Moreover, the use of additional cellular models would help to better define the potential role of KCNH1 in the nuclear translocation of vimentin.

Negli ultimi anni è emerso un crescente interesse nei confronti dei G-quadruplex (G4) come potenziali bersagli terapeutici in ambito oncologico. Queste strutture secondarie non canoniche del DNA, che si formano in sequenze ricche di guanina, sono infatti risultate coinvolte in numerosi processi biologici e nella progressione tumorale. La formazione e la stabilità dei G4 risultano fortemente influenzate da fattori intracellulari, in particolare dalla concentrazione di cationi monovalenti, quali il potassio. Parallelamente, recenti evidenze suggeriscono che anche vimentina, marker dell’epithelial–mesenchymal transition (EMT) e proteina storicamente considerata citoscheletrica, sia in grado di interagire con i G4 a livello nucleare. Nell’ambito di questo progetto di tesi, con lo scopo generale di definire se la presenza di vimentina a livello nucleare sia influenzata dalla stabilità e dal numero dei G4, è stato eseguito il knock-down di KCNH1 (potassium voltage-gated channel subfamily H member 1). Infatti, questo gene codifica il canale del potassio voltaggio-dipendente hEAG1 ed è già stato riportato in grado di modulare la concentrazione intracellulare di potassio e, di conseguenza, influenzare la formazione e la stabilità dei G4 a livello nucleare. L’obiettivo era valutare se la riduzione dell’espressione di KCNH1 potesse aumentare il numero di G4 nucleari e se tale variazione fosse associata alla presenza di vimentina nel nucleo. Basandosi su dati preliminari di espressione di KCNH1 in diverse linee cellulari di tumore mammario umano mediante realtime-quantitative PCR (qPCR), è stata scelta la linea cellulare BT549 come modello in vitro. Il knock-down del trasportatore è stato ottimizzato testando diverse condizioni di trasfezione e cercando un equilibrio tra l’efficienza del silenziamento e la citotossicità. L’efficacia del knock-down è stata valutata con l’analisi dell’espressione genica mediante qPCR. È stato ottenuto un buon livello di knock-down per KCNH1. Per quanto riguarda l’espressione di vimentina, invece non sono state osservate differenze tra le cellule trattate con siRNA specifico per KCNH1 e i controlli. Successivamente, è stata valutata la distribuzione dei G4 a livello nucleare mediante immunofluorescenza, utilizzando diversi anticorpi specifici per queste strutture. L’analisi dei risultati ha evidenziato alcune criticità, in particolare relative alla specificità degli anticorpi impiegati per la rilevazione di queste strutture non canoniche. Sono per questo necessarie ulteriori indagini al fine di ottimizzare la visualizzazione dei G4. Questo progetto di tesi deve essere considerato come uno studio preliminare, che necessita di una validazione tramite la quantificazione delle proteine codificate da KCNH1 e da VIM, in modo da valutare la traduzione del canale del potassio voltaggio-dipendente Eag1 e confermare la traslocazione nucleare di vimentina. Inoltre, l’utilizzo di altri modelli cellulari aiuterebbe a definire il ruolo potenziale di KCNH1 nella traslocazione nucleare di vimentina.