Studio dell'attività farmacologica di ligandi del recettore NOP mediante il saggio di bioluminescenza cAMP-GloSensor

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) costituiscono la principale famiglia di recettori di membrana nell’uomo e rappresentano target farmacologici di primaria importanza in quanto risultano coinvolti nella modulazione di numerosi processi fisiologici. Di per sé, infatti, sono bersaglio diretto di almeno metà dei farmaci in commercio. Rappresentano un nodo centrale nella comunicazione tra segnali extracellulari e risposte intracellulari per via dell’interazione con proteine G eterotrimeriche, complessi in grado di modulare complessi enzimatici e canali ionici. Le proteine G eterotrimeriche si suddividono in quattro principali famiglie (Gi/o, Gs, Gq/11 e G12/13), ciascuna delle quali modula specifici secondi messaggeri. In particolare, l’attivazione delle proteine Gi/o esercita un effetto inibitorio sui canali del calcio, aprono le conduttanze del potassio e inibiscono l'adenilato ciclasi. Quest’ultimo effetto causa una riduzione dei livelli intracellulari di cAMP, un secondo messaggero chiave nella regolazione di numerose funzioni biologiche. All’interno della famiglia dei recettori oppioidi che appartengono alla classe dei GPCR si distingue per le sue caratteristiche farmacologiche il recettore NOP, che riconosce come ligando endogeno selettivo il neuropeptide nocicettina/orfanina FQ (N/OFQ) e il suo accoppiamento è quasi esclusivamente Gi/o. La distribuzione del sistema NOP-N/OFQ nel sistema nervoso centrale e in diversi tessuti periferici conferisce un ruolo rilevante nella regolazione della nocicezione, delle risposte emotive e dei meccanismi motivazionali, rendendolo un bersaglio interessante in ambito farmacologico per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che coinvolgono dolore, stress, disturbi dell’umore e dipendenze e patologie invalidanti come il Parkinson. Questo è testimoniato dai numerosi ligandi portati in fase di sviluppo clinico. Il presente lavoro di tesi, caratterizzato da un approccio sperimentale in vitro, è finalizzato allo studio funzionale di una serie di ligandi per il recettore NOP mediante un saggio innovativo basato sulla bioluminescenza in grado di valutare la concentrazione di cAMP. A tale scopo è stata utilizzata la linea cellulare HEK293, esprimente stabilmente il recettore NOP umano e sottoposta a trasfezione transiente con il biosensore GloSensor™ cAMP. L’agonista endogeno, N/OFQ ha mostrato elevati valori di potenza ed effetti massimi (pEC50 10.09 e Emax 76.16 %); mentre gli antagonisti selettivi e competitivi SB-612111 e BTRX-246040 elevati valori di (rispettivamente pA2 9.20 e 9.70) e comportamento competitivo, in linea con quanto riportato in letteratura; contribuendo alla validazione del saggio. Infine, i risultati ottenuti con agonisti peptidici e non peptidici sono stati comparati con altri saggi confermando la validità del metodo utilizzato in questa tesi e contribuendo ad una maggior comprensione sia della farmacologia e del signaling del sistema N/OFQ-NOP che dell’utilizzo di questo saggio per GPCR di tipo inibitorio.