Background: Brain metastases (BM) are an increasingly frequent complication of advanced breast cancer (BC), associated with substantial morbidity and mortality, thus underscoring the need for novel therapeutic targets. The tumor microenvironment of BCBMs is characterized by a predominance of myeloid cells, including microglia and tumor-associated macrophages (TAMs). Prior evidence indicates that high intratumoral density of CD163+ cells (putatively M2-polarized macrophages) correlates with worse overall survival in HER2- BCBMs. A deeper understanding of tumor–immune interactions, involving both myeloid and lymphoid compartments, in the BM niche is therefore of interest. Objective: To characterize the impact of spatial interaction with BC cells on immune cell regulation in BCBMs. Spatial transcriptomics was applied to compare gene expression profiles of CD68+ (myeloid) and CD3+ (lymphoid) areas of interest (AOIs) between tumor-proximal (intratumoral) and tumor-distal regions, to identify tumor-driven transcriptional features. Methods: Patients undergoing surgical resection of BCBMs were retrospectively included. Clinical and pathological data were collected; hormone receptor (HR) and HER2 status were assessed by immunohistochemistry on BM samples. Formalin-fixed paraffin-embedded tissues were stained for CD68, CD3and cytokeratin (CK), and analyzed using the NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler platform. Areas of interest (AOIs) were selected based on immune markers (CD68+ macrophage-rich and CD3+ T-cell-rich areas) and classified as proximal or distal relative to tumor regions. Data processing was performed in R using standR for quality control (QC) and the limma-voom pipeline for differential expression analysis. Results: Twenty-four patients were included. Median age at primary BC diagnosis and at BM diagnosis was 47 and 51 years, respectively. Most patients had good performance status (>70, 91.7%) and a single BM lesion (66.7%). Median overall survival from BM diagnosis was 21 months. BC subtypes on BM tissue were: HR+/HER2- (n=9), HR+/HER2+ (n=4), HR-/HER2+ (n=5), HR-/HER2- (n=6). A total of 565 initial AOIs were analyzed (495 proximal, 70 distal; 197 CD68+, 171 CD3+, 197 CK+). QC excluded 511 low-expression genes and 35 low-quality AOIs, yielding 530 high-quality AOIs (193 CD68+, 140 CD3+, 197 CK+), validated by PCA and UMAP. In CD68+ regions, 19 differentially expressed genes were identified, including 5 upregulated and 14 downregulated genes (i.e. CSF1R, HMOX1, SELENOP) in tumour-proximal versus tumour-distal areas. In CD3+ regions, 55 differentially expressed genes were identified, including 5 upregulated and 50 downregulated genes (i.e. SPP1, CD276/B7H3, PLP1, SELENOP) in tumour-proximal versus tumour-distal areas. Among differentially expressed genes, several key regulators of immune cell biology emerged (CSF1R, HMOX1, SPP1, CD276). Mature oligodendrocyte markers (MBP, PLP1, MAG, MYRF, QKI) and epithelial/tumour markers (CLDN4, MAL2, RAB25) were also identified, possibly reflecting contamination from adjacent cell populations. Conclusions: Spatial transcriptomic analysis revealed spatial differences in the transcriptomic regulation of immune cells in BCBMs, supporting the existence of localized tumor–immune interactions which may contribute to immune evasion. These results suggest putative therapeutic targets and provide a rationale for future studies assessing the potential therapeutic role of these targets in BCBMs.

Contesto: Le metastasi cerebrali (BM) rappresentano complicanza frequente del carcinoma mammario avanzato (BC), con forte impatto su morbidità e mortalità, che rende necessario lo sviluppo di nuovi farmaci. Il microambiente tumorale delle BCBM è caratterizzato da predominanza di cellule mieloidi, tra cui microglia e macrofagi tumore associati (TAMs). Evidenze pregresse associano alta densità intratumorale di cellule CD163+ (macrofagi M2) a prognosi peggiore in BCBM HER2-. Dunque, approfondire la comprensione delle interazioni tra tumore e cellule immunitarie, sia mieloidi che linfoidi, risulta di notevole interesse. Scopo: Caratterizzare l’impatto delle interazioni spaziali delle cellule di BC sulla regolazione delle cellule immunitarie nelle BCBM. Con trascrittomica spaziale sono stati comparati i profili di espressione genica di aree di interesse CD68+ (mieloidi) e CD3+ (linfoidi) tra regioni prossimali (intratumorali) e distali al tumore, al fine di identificare le caratteristiche trascrizionali guidate dal tumore. Metodi: Sono stati inclusi retrospettivamente pazienti operati per resezione di BCBM. Sono stati raccolti i dati clinico-patologici; lo stato dei recettori ormonali (HR) e di HER2 sulle BM è stato valutato con immunoistochimica. I tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffine sono stati marcati per CD68, CD3 e citocheratine (CK), e analizzati con piattaforma NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler. Sono state selezionate aree di interesse (AOI) sulla base dei marcatori immunitari (CD68+ ricche di macrofagi e CD3+ ricche di linfociti T) e classificate in prossimali e distali rispetto al tumore. L’analisi dei dati si è svolta in R tramite standR per il controllo qualità (QC) e algoritmi limma-voom per l’analisi di espressione differenziale. Risultati: Ventiquattro pazienti sono state incluse. L’età mediana alla prima diagnosi di BC e di BM è stata di 47 e 51 anni, rispettivamente. La maggior parte dei pazienti mostrava buon performance status (>70, 91.7%) e lesione singola (66.7%). La sopravvivenza globale mediana dalla diagnosi di BM è di 21 mesi. I sottotipi di BM rilevati sono: HR+/HER2- (n=9), HR+/HER2+ (n=4), HR-/HER2+ (n=5), HR-/HER2- (n=6). Sono state analizzate 565 AOI iniziali (495 prossimali, 70 distali; 197 CD68+, 171 CD3+, 197 CK+). Il controllo qualità ha filtrato 511 geni a bassa espressione e 35 AOI di bassa qualità, ottenendo 530 AOI di alta qualità (193 CD68+, 140 CD3+, 197 CK+), validate con PCA e UMAP. Nelle regioni CD68+ sono stati identificati 19 geni differenzialmente espressi, di cui 5 iperespressi e 14 ipoespressi (es. CSF1R, HMOX1, SELENOP) in regioni prossimali rispetto alle distali al tumore. Nelle regioni CD3+ sono stati identificati 55 geni differenzialmente espressi, di cui 5 iperespressi e 50 ipoespressi (es. SPP1, CD276/B7H3, PLP1, SELENOP) in regioni prossimali rispetto alle distali al tumore. Emergono diversi regolatori immunitari (CSF1R, HMOX1, SPP1, CD276). Sono stati identificati anche marcatori oligodendrocitici (MBP, PLP1, MAG, MYRF, QKI) e marcatori epiteliali/tumorali (CLDN4, MAL2, RAB25) derivanti da una verosimile contaminazione. Conclusioni: L’analisi di trascrittomica spaziale ha rivelato differenze spaziali nella regolazione immune delle BCBM, supportando l’esistenza di interazioni locali tra tumore e immunità possibilmente implicate nell’immunoevasione. I risultati suggeriscono possibili bersagli terapeutici e giustificano studi futuri di questi target nel contesto delle BCBM.

Analisi di trascrittomica spaziale di metastasi cerebrali da carcinoma mammario

BERTOLLO, TOMMASO
2025/2026

Abstract

Background: Brain metastases (BM) are an increasingly frequent complication of advanced breast cancer (BC), associated with substantial morbidity and mortality, thus underscoring the need for novel therapeutic targets. The tumor microenvironment of BCBMs is characterized by a predominance of myeloid cells, including microglia and tumor-associated macrophages (TAMs). Prior evidence indicates that high intratumoral density of CD163+ cells (putatively M2-polarized macrophages) correlates with worse overall survival in HER2- BCBMs. A deeper understanding of tumor–immune interactions, involving both myeloid and lymphoid compartments, in the BM niche is therefore of interest. Objective: To characterize the impact of spatial interaction with BC cells on immune cell regulation in BCBMs. Spatial transcriptomics was applied to compare gene expression profiles of CD68+ (myeloid) and CD3+ (lymphoid) areas of interest (AOIs) between tumor-proximal (intratumoral) and tumor-distal regions, to identify tumor-driven transcriptional features. Methods: Patients undergoing surgical resection of BCBMs were retrospectively included. Clinical and pathological data were collected; hormone receptor (HR) and HER2 status were assessed by immunohistochemistry on BM samples. Formalin-fixed paraffin-embedded tissues were stained for CD68, CD3and cytokeratin (CK), and analyzed using the NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler platform. Areas of interest (AOIs) were selected based on immune markers (CD68+ macrophage-rich and CD3+ T-cell-rich areas) and classified as proximal or distal relative to tumor regions. Data processing was performed in R using standR for quality control (QC) and the limma-voom pipeline for differential expression analysis. Results: Twenty-four patients were included. Median age at primary BC diagnosis and at BM diagnosis was 47 and 51 years, respectively. Most patients had good performance status (>70, 91.7%) and a single BM lesion (66.7%). Median overall survival from BM diagnosis was 21 months. BC subtypes on BM tissue were: HR+/HER2- (n=9), HR+/HER2+ (n=4), HR-/HER2+ (n=5), HR-/HER2- (n=6). A total of 565 initial AOIs were analyzed (495 proximal, 70 distal; 197 CD68+, 171 CD3+, 197 CK+). QC excluded 511 low-expression genes and 35 low-quality AOIs, yielding 530 high-quality AOIs (193 CD68+, 140 CD3+, 197 CK+), validated by PCA and UMAP. In CD68+ regions, 19 differentially expressed genes were identified, including 5 upregulated and 14 downregulated genes (i.e. CSF1R, HMOX1, SELENOP) in tumour-proximal versus tumour-distal areas. In CD3+ regions, 55 differentially expressed genes were identified, including 5 upregulated and 50 downregulated genes (i.e. SPP1, CD276/B7H3, PLP1, SELENOP) in tumour-proximal versus tumour-distal areas. Among differentially expressed genes, several key regulators of immune cell biology emerged (CSF1R, HMOX1, SPP1, CD276). Mature oligodendrocyte markers (MBP, PLP1, MAG, MYRF, QKI) and epithelial/tumour markers (CLDN4, MAL2, RAB25) were also identified, possibly reflecting contamination from adjacent cell populations. Conclusions: Spatial transcriptomic analysis revealed spatial differences in the transcriptomic regulation of immune cells in BCBMs, supporting the existence of localized tumor–immune interactions which may contribute to immune evasion. These results suggest putative therapeutic targets and provide a rationale for future studies assessing the potential therapeutic role of these targets in BCBMs.
Dipartimento di Medicina - DIMED
2025
Spatial transcriptomics analysis of brain metastases from breast cancer
Contesto: Le metastasi cerebrali (BM) rappresentano complicanza frequente del carcinoma mammario avanzato (BC), con forte impatto su morbidità e mortalità, che rende necessario lo sviluppo di nuovi farmaci. Il microambiente tumorale delle BCBM è caratterizzato da predominanza di cellule mieloidi, tra cui microglia e macrofagi tumore associati (TAMs). Evidenze pregresse associano alta densità intratumorale di cellule CD163+ (macrofagi M2) a prognosi peggiore in BCBM HER2-. Dunque, approfondire la comprensione delle interazioni tra tumore e cellule immunitarie, sia mieloidi che linfoidi, risulta di notevole interesse. Scopo: Caratterizzare l’impatto delle interazioni spaziali delle cellule di BC sulla regolazione delle cellule immunitarie nelle BCBM. Con trascrittomica spaziale sono stati comparati i profili di espressione genica di aree di interesse CD68+ (mieloidi) e CD3+ (linfoidi) tra regioni prossimali (intratumorali) e distali al tumore, al fine di identificare le caratteristiche trascrizionali guidate dal tumore. Metodi: Sono stati inclusi retrospettivamente pazienti operati per resezione di BCBM. Sono stati raccolti i dati clinico-patologici; lo stato dei recettori ormonali (HR) e di HER2 sulle BM è stato valutato con immunoistochimica. I tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffine sono stati marcati per CD68, CD3 e citocheratine (CK), e analizzati con piattaforma NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler. Sono state selezionate aree di interesse (AOI) sulla base dei marcatori immunitari (CD68+ ricche di macrofagi e CD3+ ricche di linfociti T) e classificate in prossimali e distali rispetto al tumore. L’analisi dei dati si è svolta in R tramite standR per il controllo qualità (QC) e algoritmi limma-voom per l’analisi di espressione differenziale. Risultati: Ventiquattro pazienti sono state incluse. L’età mediana alla prima diagnosi di BC e di BM è stata di 47 e 51 anni, rispettivamente. La maggior parte dei pazienti mostrava buon performance status (>70, 91.7%) e lesione singola (66.7%). La sopravvivenza globale mediana dalla diagnosi di BM è di 21 mesi. I sottotipi di BM rilevati sono: HR+/HER2- (n=9), HR+/HER2+ (n=4), HR-/HER2+ (n=5), HR-/HER2- (n=6). Sono state analizzate 565 AOI iniziali (495 prossimali, 70 distali; 197 CD68+, 171 CD3+, 197 CK+). Il controllo qualità ha filtrato 511 geni a bassa espressione e 35 AOI di bassa qualità, ottenendo 530 AOI di alta qualità (193 CD68+, 140 CD3+, 197 CK+), validate con PCA e UMAP. Nelle regioni CD68+ sono stati identificati 19 geni differenzialmente espressi, di cui 5 iperespressi e 14 ipoespressi (es. CSF1R, HMOX1, SELENOP) in regioni prossimali rispetto alle distali al tumore. Nelle regioni CD3+ sono stati identificati 55 geni differenzialmente espressi, di cui 5 iperespressi e 50 ipoespressi (es. SPP1, CD276/B7H3, PLP1, SELENOP) in regioni prossimali rispetto alle distali al tumore. Emergono diversi regolatori immunitari (CSF1R, HMOX1, SPP1, CD276). Sono stati identificati anche marcatori oligodendrocitici (MBP, PLP1, MAG, MYRF, QKI) e marcatori epiteliali/tumorali (CLDN4, MAL2, RAB25) derivanti da una verosimile contaminazione. Conclusioni: L’analisi di trascrittomica spaziale ha rivelato differenze spaziali nella regolazione immune delle BCBM, supportando l’esistenza di interazioni locali tra tumore e immunità possibilmente implicate nell’immunoevasione. I risultati suggeriscono possibili bersagli terapeutici e giustificano studi futuri di questi target nel contesto delle BCBM.
Breast cancer
Brain metastases
Transcriptomics
Spatial
Gene expression
GRIGUOLO, GAIA
BICCIATO, SILVIO
Lauree magistrali a ciclo unico
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