Yeast functional validation of ASL variants found in a patient with a complex phenotype characterized by neurodevelopmental delay

BACKGROUND: The widespread implementation of next-generation sequencing (NGS) technologies has markedly increased the identification of genetic variants, including a growing number of variants of uncertain significance (VUS), whose pathogenic role often remains unclear. This highlights the need for rapid, reliable, and easily reproducible in vitro functional assays capable of assessing the impact of VUS on gene product function and supporting variant interpretation in clinical settings. AIM OF THE STUDY: In this study, we developed a functional assay in Saccharomyces cerevisiae as a model system for the characterization of three VUS in ASL identified in a patient presenting with neurodevelopmental delay, incoercible vomit, dysmorphisms and hypothyroidism. This assay was designed with the objective of evaluating the functional impact of the variants D61Y, A300S, G305R on the corresponding genetic product, to support the clinical interpretation of the variants identified through a NGS approach. This gene codes for Argininosuccinic Lyase, an enzyme belonging to the urea cycle. Mutations in this gene cause Argininosuccinic Aciduria, a disease characterized by a wide phenotypical spectrum, going from neonatal onset forms, typically presenting with hyperammonemic encephalopathy, lethargy, seizures, respiratory alkalosis, and potentially fatal metabolic decompensation, to late-onset forms associated with developmental delay, cognitive impairment, behavioral abnormalities, chronic liver dysfunction, and episodic hyperammonemia. MATERIALS AND METHODS: To assess the functional impact of the variants, we used a model based on Saccharomyces cerevisiae. The functional assay was used on the D61Y, A300S and G305R ASL gene variants, analyzing the functional complementation capacity and evaluating growth as an indicator of the genetic product’s activity. RESULTS: Functional complementation analyses demonstrated preserved activity for the A300S variant, supporting its classification as a benign polymorphism according to ACMG criteria (likely benign, ACMG class 2). In contrast, the D61Y and G305R variants showed impaired functional complementation, consistent with a deleterious effect on protein function and supporting their classification as likely pathogenic variants (ACMG class 4). Notably, the functional results were concordant with the mild clinical phenotype observed in the patient. CONCLUSIONS: These findings support the utility of yeast-based in vitro assays as fast, cost-effective, and reliable tools for the functional interpretation of VUS identified through NGS approaches in inherited metabolic disorders.

PRESUPPOSTI DELLO STUDIO: La diffusa implementazione delle tecnologie di next-generation sequencing (NGS) ha notevolmente aumentato l’identificazione di varianti genetiche, incluso un numero crescente di varianti di significato incerto (VUS), il cui ruolo patogenetico rimane spesso poco chiaro. Ciò evidenzia la necessità di saggi funzionali in vitro rapidi, affidabili e facilmente riproducibili, in grado di valutare l’impatto delle VUS sulla funzione del prodotto genico e di supportare l’interpretazione delle varianti in ambito clinico. SCOPO DELLO STUDIO: In questo studio, abbiamo sviluppato un saggio funzionale in Saccharomyces cerevisiae come sistema modello per la caratterizzazione di tre VUS nel gene ASL identificate in un paziente che presentava ritardo dello sviluppo, vomito incoercibile, dismorfismi e ipotiroidismo. Il saggio è stato progettato con l’obiettivo di valutare l’impatto funzionale delle varianti D61Y, A300S e G305R sul corrispondente prodotto genico, al fine di supportare l’interpretazione clinica delle varianti identificate mediante approcci NGS.Questo gene codifica per l’Argininosuccinico Liasi, un enzima appartenente al ciclo dell’urea. Mutazioni in questo gene causano Argininosuccinico Aciduria, una malattia caratterizzata da un ampio spettro fenotipico, che va dalle forme ad esordio neonatale, tipicamente caratterizzate da encefalopatia iperammoniemica, letargia, convulsioni, alcalosi respiratoria e scompenso metabolico potenzialmente fatale, alle forme a esordio tardivo associate a ritardo dello sviluppo, compromissione cognitiva, alterazioni comportamentali, disfunzione epatica cronica ed episodi di iperammoniemia. MATERIALI E METODI: Per la valutazione funzionale delle varianti, è stato utilizzato un sistema modello basato su Saccharomyces cerevisiae. Il saggio funzionale è stato applicato alle varianti D61Y, A300S e G305R del gene ASL, con analisi della capacità di complementazione funzionale e valutazione della crescita cellulare come indicatori dell’attività del prodotto genico. RISULTATI: Le analisi di complementazione funzionale hanno dimostrato un’attività conservata per la variante A300S, supportandone la classificazione come polimorfismo benigno secondo i criteri ACMG (likely benign, classe ACMG 2). Al contrario, le varianti D61Y e G305R hanno mostrato una ridotta crescita e una compromessa complementazione funzionale, coerenti con un effetto deleterio sulla funzione proteica e a supporto della loro classificazione come varianti probabilmente patogenetiche (likely pathogenic, classe ACMG 4). È importante sottolineare che i risultati funzionali erano concordanti con il fenotipo clinico lieve osservato nel paziente. CONCLUSIONI: Questi risultati supportano l’utilità dei saggi in vitro basati sul lievito come strumenti rapidi, economici e affidabili per l’interpretazione funzionale delle VUS identificate mediante approcci NGS nelle malattie metaboliche ereditarie.