Messa a punto di strategie per lo studio dell'interattoma della proteina LRRC8A

VRAC (Volume-Regulated Anion Channel) è un canale anionico ubiquitario, localizzato nella membrana plasmatica e/o lisosomiale delle cellule. L’attivazione fisiologica di VRAC avviene primariamente per la regolazione del volume cellulare, in quanto esso funge da sensore dello stress osmotico. Inoltre, VRAC è coinvolto in molteplici processi come la regolazione del potenziale di membrana, la secrezione di fluidi e di insulina, il rilascio di glutammato da parte degli astrociti, la proliferazione, la motilità e la differenziazione cellulare, lo sviluppo dei linfociti immunitari, il metabolismo degli adipociti, l’apoptosi e la resistenza a farmaci antitumorali. Nonostante la proteina VRAC sia stata ampiamente studiata, a partire dagli anni ‘80, da un punto di visto elettrofisiologico, la sua caratterizzazione molecolare è avvenuta solamente nel 2014, quando due gruppi indipendenti dimostrarono che VRAC è un canale eteromerico codificato da cinque membri della famiglia di geni Lrrc8 (Lrrc8A–E). Ad oggi, è chiaro che VRAC richiede la subunità LRRC8A obbligatoria e almeno un'isoforma LRRC8B-E aggiuntiva per essere funzionale. Nel campo oncologico, l’interesse di VRAC come potenziale nuovo target terapeutico rende questa proteina oggetto di numerose ricerche, i cui esiti sono a volte poco chiari e contraddittori. Questa tesi ha l’obiettivo di presentare ed analizzare i risultati, ed in particolare, le metodologie che ho utilizzato durante il mio internato di tesi. Il lavoro del laboratorio in cui ho svolto l’esperienza di tesi è focalizzato sull’analisi del ruolo di VRAC nel tumore al colon-retto. Attualmente lo studio è incentrato sul ruolo della proteina LRRC8A in cellule tumorali umane e murine. In particolare, il mio contributo si è inserito nei seguenti aspetti: • Genome editing - creazione di una linea cellulare murina (CT26) knockout per LRRC8A • Produzione di una linea cellulare murina (CT26) esprimente la proteina di fusione LRRC8A-BirA*-HA (costrutto BioID).