AA Amyloidosis detection in cats: Comparison and evaluation of histopathological protocols, fluorescence microscopy, and digital pathology approach

AA amyloidosis is a systemic disorder characterized by the extracellular deposition of insoluble protein fibrils, deriving from the serum amyloid A (SAA) misfolding, primarily affecting the kidney, liver, and spleen. Standard histopathological diagnosis relies on Congo Red staining and the observation of its characteristic apple-green birefringence under polarized light. However, diagnostic accuracy can be heavily influenced by technical variables, including the staining protocol and section thickness. This study aimed to compare three Congo Red staining protocols: our university laboratory’s internal standard, the widely validated Puchtler method, and a modified fast protocol derived from recent literature. The protocols differed in section thickness, chemical modifications of the Congo Red solution, and incubation times of the slide in the solution. Additionally, we investigated the potential of fluorescence microscopy and an ImageJ-based digital analysis pipeline as supportive diagnostic tools. Evaluation of the three staining methods was performed across feline livers, kidneys and spleens sections, assessing amyloid staining intensity, birefringence quality, and background noise to determine overall diagnostic performance under bright field and polarized light. Slides were subsequently analyzed under fluorescence microscopy, and processed through the digital pipeline. Our findings revealed that thicker histological sections significantly enhanced diagnostic quality compared to thinner ones, markedly increasing amyloid staining intensity, background quality, and deposit visibility, with some differences between the various organs. Among the tested procedures, the Puchtler method offered the best compromise between diagnostic excellence and processing speed. The fast protocol also demonstrated high diagnostic performance, yielding intense amyloid staining, though accompanied by a slightly higher non-specific background. Fluorescence microscopy successfully highlighted amyloid deposits with high contrast, enabling low-magnification screening and the detection of minute deposits easily missed by bright-field microscopy. Furthermore, preliminary analysis with the ImageJ pipeline proved the potential of digital tools for automated deposit identification, also representing a possibility for objective quantification. This study underscores that optimizing staining protocols is a key factor in improving the accuracy and quality of AA amyloidosis diagnosis. Integrating optimized histological methods with fluorescence microscopy and digital pathology pipelines represents a promising avenue toward a more accurate, standardized, and operator-independent diagnostic workflow

L'amiloidosi AA è una patologia da misfolding (mal ripiegamento) proteico in cui la proteina siero amiloide A (SAA) va incontro a una transizione strutturale che la rende insolubile. La conseguente formazione e deposizione di fibrille amiloidi avviene a livello extracellulare, interessando in modo predominante il fegato, il rene e la milza. La diagnosi istopatologica si basa tradizionalmente sulla colorazione Rosso Congo e sull'osservazione della caratteristica birifrangenza verde mela in luce polarizzata; tuttavia, l'accuratezza diagnostica può essere influenzata da numerose variabili tecniche, tra cui il protocollo di colorazione utilizzato e lo spessore delle sezioni istologiche. Lo scopo di questo studio è stato quello di confrontare tre protocolli di colorazione Rosso Congo: lo standard interno del laboratorio dell’università, il metodo di Puchtler, ampiamente descritto e validato in letteratura, e una metodica fast ricavata da alcuni lavori più recenti. Le variabili tra i vari protocolli risiedono principalmente nel diverso spessore della fetta, nelle modificazioni chimiche della soluzione di Rosso Congo utilizzata e nei tempi di contatto della fetta istologica con tale soluzione. Inoltre, sono state investigate le potenzialità della microscopia a fluorescenza e di un sistema di analisi digitale basato su una pipeline di ImageJ come strumenti di supporto alla diagnosi. I risultati hanno evidenziato che l'impiego di sezioni istologiche più spesse determina un sensibile miglioramento della qualità diagnostica rispetto alle sezioni di spessore inferiore, aumentando l'intensità della colorazione dell'amiloide, migliorando il background e quindi e la riconoscibilità dei depositi, con alcune differenze nei vari tessuti. Tra i protocolli valutati, il metodo di Puchtler ha mostrato il miglior compromesso tra qualità diagnostica e rapidità di esecuzione. Anche il protocollo rapido ha dimostrato elevate prestazioni diagnostiche, producendo una colorazione dell'amiloide più intensa, sebbene associata a un fondo leggermente più aspecifico. La microscopia a fluorescenza ha confermato la capacità, già descritta in letteratura, di evidenziare correttamente i depositi di amiloide, con un elevato contrasto sullo sfondo, dando la possibilità di esaminare il vetrino anche a basso ingrandimento e mostrando anche depositi piccoli e difficilmente visibili al microscopio ottico. L'analisi preliminare con l’utilizzo della pipeline ha inoltre dimostrato il potenziale di questo strumento nell'identificazione automatizzata dei depositi, fornendo le basi per una più corretta e oggettiva quantificazione del processo. Nel complesso, questo studio evidenzia come l'ottimizzazione dei protocolli di colorazione rappresenti un elemento determinante per migliorare accuratezza e qualità della diagnosi dell'amiloidosi A. L'integrazione di metodiche istologiche ottimizzate con microscopia a fluorescenza e strumenti digitali costituisce un’importante prospettiva per rendere la diagnosi più accurata, standardizzata e meno dipendente dall'esperienza dell'operatore.