Messa a punto di un protocollo di estrazione di RNA da sangue felino ai fini dell’utilizzo in studi di nutrigenomica e tossicogenomica comparata

Il sequenziamento dell’RNA (RNA-sequencing, RNA-seq) è una metodologia -omica che consente di valutare gli effetti di stress biotici od abiotici sull’omeostasi animale, ed in particolare sul suo trascrittoma. Sebbene molto utilizzata in ambito biomedico, nelle scienze veterinarie ed in particolare nella specie felina sono tuttora scarsi i riferimenti bibliografici concernenti l’uso di tale metodologia biomolecolare. Uno dei potenziali problemi nell’esecuzione delle indagini di trascrittomica è rappresentato dalla bontà del protocollo di estrazione dell’acido nucleico nonché la sua successiva valutazione quali-quantitativa. Infatti, l’interpretazione biologica dei dati grezzi può essere inficiata dal metodo di estrazione utilizzato, è quindi opportuno mettere a punto protocolli specifici per specie e matrice tissutale oggetto di studio. Lo scopo di questa tesi è stato quello di identificare un metodo efficiente di estrazione di RNA da sangue felino da utilizzarsi consecutivamente in studi di RNA-seq. In particolare, sono stati comparativamente valutati due protocolli di estrazione, che hanno previsto l’utilizzo di un kit di estrazione (1) colonnine per estrazione in fase solida o (2) l’utilizzo di TRIzol LS Reagent, un reagente per l’estrazione di acidi nucleici da campioni biologici liquidi, quale appunto è il sangue. La concentrazione, la purezza e l’integrità di RNA dell’acido nucleico estratto sono state valutate mediante NanoDrop e TapeStation. I risultati ottenuti e relativi alla quantità di acido nucleico estratto e alla sua qualità, stimata con la determinazione dei rapporti tra le assorbanze misurate allo spettrofotometro alle lunghezze d’onda di 230, 260 e 280 nm (A260/280 e A260/230) indicano che il TRIzol LS Reagent è sicuramente il reagente più adatto per l’estrazione di RNA totale da sangue felino. Inoltre, i risultati ottenuti tramite l’analisi con TapeStation suggeriscono che i campioni, che presentano un valore di RNA Integrity Number (RIN) superiore a 5, possono essere utilizzati per l’allestimento delle relative librerie e l’inoltro al centro di sequenziamento. Per contro, gli analoghi parametri ottenibili con l’utilizzo del kit di estrazione e le relative colonnine, risultano essere inferiori e, pertanto, non ideali.