CRISPR-Cas9, da sistema adattativo batterico a rivoluzione della medicina molecolare. Struttura, funzioni e applicazione sul gene ATAD3B.

CRISPR-Cas9 system-mediated genome editing represents a fundamental biotechnological innovation resulting from the conversion of a bacterial immune system. Operating as a “molecular scissors”, the Cas9 endonuclease creates specific cuts on target DNA, triggering natural repair mechanisms. This paper analyzes the molecular architecture of the system, exploring its protein domains and specificity of action. The theoretical foundations are subsequently applied to the characterization of the ATAD3B gene, encoding a mitochondrial protein which, at the laboratory where this thesis was carried out, was identified as selectively expressed in some types of highly malignant and metastatic tumors. For this reason, our laboratory hypothesizes that its silencing may determine, at least partially, a reversion of the malignant phenotype associated with it. Due to the very high sequence homology (greater than ’85%) to the paralog gene ATAD3A, traditional gene manipulation techniques frequently cause nonspecific silencing and cell mortality. The use of CRISPR-Cas9 technology allows, on the contrary, to induce a targeted and highly specific knockout on ATAD3B, with the ultimate goal of defining the function and thoroughly investigating its pathophysiological role.

L’editing genomico mediato dal sistema CRISPR-Cas9 rappresenta un’innovazione biotecnologica fondamentale, derivata dalla conversione di un sistema immunitario batterico. Operando come una “forbice molecolare”, l’endonucleasi Cas9 crea tagli specifici sul DNA bersaglio, innescando meccanismi di riparazione naturale. Questo elaborato analizza l’architettura molecolare del sistema, esplorandone i domini proteici e la specificità d’azione. Le basi teoriche sono successivamente applicate alla caratterizzazione del gene ATAD3B, codificante per una proteina mitocondriale che, presso il laboratorio in cui è stata svolta questa tesi, è stata identificata come selettivamente espressa in alcuni tipi di tumori altamente maligni e metastatici. Per questo motivo, il nostro laboratorio ipotizza che il suo silenziamento possa determinare, almeno parzialmente, una reversione del fenotipo maligno ad essa associato. A causa dell’altissima omologia di sequenza (superiore all’85%) con il gene paralogo ATAD3A, le tecniche tradizionali di manipolazione genica causano frequentemente silenziamenti aspecifici e mortalità cellulare. L’impiego della tecnologia CRISPR-Cas9 permette, al contrario, di indurre un knock-out mirato e altamente specifico su ATAD3B, con l’obiettivo finale di definire la funzione e indagarne a fondo il ruolo patofisiologico.