Approcci di screening in vitro per l'identificazione di modulatori della polimerizzazione di vimentina: sviluppo e ottimizzazione del protocollo sperimentale

Vimentina, proteina appartenente ai filamenti intermedi, regola la plasticità cellulare, promuove la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e la progressione metastatica. L’obiettivo di questo progetto è lo sviluppo e la validazione di una piattaforma di screening in vitro basata sul Thermal Shift Assay (TSA), per monitorare lo stato di assemblaggio della proteina ed individuare modulatori della polimerizzazione. Mediante Dynamic Light Scattering (DLS), Dicroismo Circolare (CD) e gel elettroforesi è stata controllata la qualità della proteina, analizzando dimensioni, folding e capacità di legare oligonucleotidi G4. Per validare il saggio TSA, sono stati analizzati casi di studio che perturbano gli equilibri di vimentina, tra cui variazioni di forza ionica, pH, l’utilizzo di un mutante incapace di polimerizzare e di ligandi. I dati di stabilità termica sono stati sottoposti ad un controllo incrociato mediante DLS e CD. Infine, è stata testata l’efficacia del TSA nel rilevare l’effetto di ligandi sulla polimerizzazione di vimentina; la presenza del peptide 11-30 ha mostrato variazioni significative sul read-out, confermando la capacità del saggio di rilevare interferenze sull’assemblaggio operate da piccole molecole. Il protocollo TSA si è dimostrato sensibile e idoneo per svolgere screening di molecole capaci di interferire con la polimerizzazione di vimentina ed individuare potenziali farmaci anti-metastatici.