Editing del gene hrb87F mediante CRISPR/Cas9 in cellule SR2+

Le ribonucleoproteine eterogenee nucleari (hnRNP) svolgono un ruolo chiave nella regolazione e nella maturazione dell’RNA cellulare. Questo progetto di ricerca ha l’obiettivo di caratterizzare l’hnRNP Hrb87F in Drosophila melanogaster: è stata applicata la tecnologia CRISPR/Cas9 per valutare l’efficacia di diverse guide sgRNA per la generazione di una linea cellulare S2R+ knock-out, per poter in seguito valutare gli effetti dell’assenza della proteina sul trascrittoma. Utilizzando il vettore plasmidico pAc-sgRNA-Cas9, contenente la cassetta d’espressione per Cas9 e la resistenza alla puromicina, sono state clonate e trasfettate tre diverse sequenze di sgRNA (sgHrb87F-147, sgHrb87F-170, sgHrb87F-208). Le cellule trasfettate sono state sottoposte a selezione con puromicina per ottimizzare l’efficienza del knock-out. I campioni sono stati, poi, raccolti e processati per l’estrazione di DNA, proteine e RNA, per confermare che l’editing genomico fosse effettivamente avvenuto. I risultati ottenuti confermano l’efficacia del sistema CRISPR/Cas9 nell’ingegnerizzazione di cellule S2R+ e pongono le basi per futuri studi di identificazione dell’attività di Hrb87F sui suoi target biologici.