Utilizzo di C. elegans per lo studio di correlazioni genotipo-fenotipo in malattie monogeniche.

This paper describes the characterisation of variants of uncertain significance (VUS) identified in a patient with a syndromic presentation consistent with a ciliopathy. In particular, two variants were found within the same gene in compound heterozygosity, each inherited from one of the two healthy parents, and predicted to be pathogenic; knowing this, an autosomal recessive pattern of inheritance was hypothesised. However, as these variants have not been previously reported, and as this gene has been associated exclusively with autosomal dominant inheritance, an in vivo validation was carried out. C. elegans was chosen because, in addition to having been previously used in the study of genes associated with ciliopathies, it has a well-conserved ciliary structure and offers numerous advantages in terms of maintenance and genetic manipulation. The cilia in C. elegans are located in ciliated neurons and are important for various behaviours, such as responses to chemotactic stimulation, feeding, mating and responses to mechanical stimulation. During the thesis period, phenotypic assays were carried out on strains previously generated using CRISPR/Cas9 with mutations homologous to those found in the patient, in order to assess their phenotypic, morphological and functional consequences in the nematode. The aim of this project is to validate the variants identified as pathogenic, with the goal of broadening our understanding of ciliopathies and enabling the study of new therapeutic approaches in the future.

Il presente elaborato espone la caratterizzazione di varianti dal significato incerto (VUS), identificate in un paziente con uno spettro sindromico compatibile con una ciliopatia. In particolare, sono state riscontrate due varianti a livello dello stesso gene in eterozigosi composta, ognuna ereditata da uno dei due genitori sani, e predette come patogenetiche; alla luce di questo è stata ipotizzata un’ereditarietà di tipo autosomico recessivo. Tuttavia, essendo queste varianti non pubblicate, ed essendo stato questo gene associato esclusivamente ad eredità di tipo autosomico dominante, è stata effettuata una validazione in vivo. È stato scelto C. elegans poiché, oltre ad essere stato precedentemente impiegato nello studio di geni associati a ciliopatie, presenta la struttura del cilio ben conservata e offre numerosi vantaggi nell’ambito del mantenimento e della manipolazione genetica. Il cilio in C. elegans è presente a livello dei neuroni ciliati ed è importante per diversi comportamenti, quali risposta a stimoli chemotattici, nutrimento, accoppiamento e risposta a stimoli meccanici. Durante il periodo di tesi sono stati effettuati dei saggi fenotipici in linee precedentemente generate tramite CRISPR/Cas9 con mutazioni omologhe a quelle riscontrate nel paziente, ai fini di valutarne le conseguenze a livello fenotipico, morfologico e funzionale nel nematode. L’obiettivo di questo progetto è quello di validare le varianti identificate come patogenetiche ai fini di ampliare le possibilità di comprendere le ciliopatie e di poter studiare, in futuro, nuovi approcci terapeutici.