Identificazione e validazione di mutanti del gene RRM2B nello zebrafish ottenuti mediante tecnologia CRISPR/Cas9

Ribonucleotide reductase (RNR) is an essential enzyme for the de novo synthesis of DNA precursors, as it catalyzes the reduction of ribonucleoside diphosphates (NDPs) into their corresponding deoxyribonucleoside diphosphates (dNDPs). Among its subunits, RRM2B plays a crucial role in maintaining mitochondrial DNA (mtDNA) copy number. Mutations in the RRM2B gene are associated with a severe encephalomyopathy characterized by reduced mtDNA copy number in multiple tissues. The aim of this thesis was to identify and characterize rrm2b mutant zebrafish (Danio rerio) generated using CRISPR/Cas9 genome editing technology. The mutant lines had been previously established by microinjecting the CRISPR/Cas9 system into fertilized eggs (F0 generation), which were subsequently crossed with wild-type fish to obtain the F1 generation. This thesis focused on the molecular screening of heterozygous mutant carriers and their subsequent breeding to generate homozygous mutant individuals required for the functional characterization of the rrm2b mutation. The development of this experimental model provides a valuable tool for investigating the pathogenic mechanisms underlying mitochondrial DNA depletion syndromes and may contribute to the identification of potential therapeutic strategies.

La ribonucleotide reduttasi (RNR) è un enzima essenziale per la sintesi de novo dei precursori del DNA, poiché catalizza la riduzione dei ribonucleotidi difosfato (NDP) nei corrispondenti deossiribonucleotidi difosfato (dNDP). Tra le sue subunità, RRM2B svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento del numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA). Mutazioni nel gene RRM2B sono associate a una grave encefalomiopatia caratterizzata da un ridotto numero di copie del mtDNA in diversi tessuti. L'obiettivo di questa tesi è stato identificare e caratterizzare mutanti del gene rrm2b nello zebrafish (Danio rerio), utilizzato come organismo modello, mediante la tecnologia di genome editing CRISPR/Cas9. Le linee mutanti erano state precedentemente generate attraverso la microiniezione del sistema CRISPR/Cas9 in uova fecondate (generazione F0), successivamente incrociate con esemplari wild type per ottenere la generazione F1. Il lavoro di tesi ha previsto lo screening molecolare degli individui eterozigoti portatori della mutazione e il loro successivo accoppiamento per ottenere animali omozigoti, necessari per la caratterizzazione della mutazione nel gene rrm2b. Lo sviluppo di questo modello sperimentale rappresenta uno strumento utile per approfondire i meccanismi patogenetici alla base delle sindromi da deplezione del DNA mitocondriale e per favorire l'identificazione di potenziali strategie terapeutiche.