Caratterizzazione e validazione di una piattaforma in vitro per stimolazione vibro-acustica: protocollo ingegneristico per esperimenti riproducibili di pre-condizionamento cellulare prima del trattamento con cisplatino

Vibro-acoustic stimulation of cell cultures represents a promising approach for the study of mechanotransduction phenomena and possible pre-conditioning effects against cytotoxic insults. However, many experimental protocols present standardization limitations, since the applied stimulus is often defined exclusively by the nominal parameters set in the software, without a direct measurement of the stress actually transmitted to the cells. The present thesis aims to characterize and validate an in vitro platform for controlled vibro-acoustic stimulation, developed at the Bioacoustics Laboratory of the University of Padua. The system comprises signal generation software, amplifier, acoustic actuators, mechanical support for multi-well plates, an MPU6050 accelerometer connected to Arduino, and environmental thermal control. In an initial phase, the protocol was applied to proliferating OC-k3 cells using the pre-existing structural configuration. Four experimental conditions were considered: untreated control, vibro-acoustic stimulation, cisplatin, and stimulation associated with cisplatin. Metabolic activity, proliferation, and cell survival were evaluated by means of the MTS assay, DAPI staining, and flow cytometry. Subsequently, in order to investigate the inconsistencies that emerged in the biological results, a software monitoring system was developed for the real-time analysis of acceleration, frequency, and temperature. This analysis revealed the presence of unwanted harmonic components, structural resonances, and variations in acceleration during the test, attributable to mechanical limitations of the initial setup. Based on this evidence, a new mechanical platform was designed and subsequently evaluated both from an instrumental point of view, to characterize the vibrational stimulus transmitted to the plate, and through preliminary biological tests with the MTS assay, aimed at verifying the reproducibility of the cellular response under more controlled stimulation conditions.

La stimolazione vibro-acustica di colture cellulari rappresenta un approccio promettente per lo studio dei fenomeni di meccano-trasduzione e dei possibili effetti di pre-condizionamento nei confronti di insulti citotossici. Tuttavia, molti protocolli sperimentali presentano limiti di standardizzazione, poiché lo stimolo applicato viene spesso definito esclusivamente dai para metri nominali impostati nel software, senza una misura diretta della sollecitazione realmente trasmessa alle cellule. La presente tesi ha l’obiettivo di caratterizzare e validare una piattaforma in vitro per stimola zione vibro-acustica controllata, sviluppata presso il Laboratorio di Bioacustica dell’Università di Padova. Il sistema comprende software di generazione del segnale, amplificatore, attuatori acustici, supporto meccanico per piastre multi-pozzetto, accelerometro MPU6050 collegato ad Arduino e controllo termico dell’ambiente. In una fase iniziale, il protocollo è stato applicato a cellule OC-k3 proliferanti utilizzando la configurazione strutturale preesistente. Sono state considerate quattro condizioni sperimentali: controllo non trattato, stimolazione vibro-acustica, cisplatino e stimolazione associata a cispla tino. L’attività metabolica, la proliferazione e la sopravvivenza cellulare sono state valutate mediante saggio MTS, colorazione con DAPI e citofluorimetria. Successivamente, al fine di investigare le incongruenze emerse nei risultati biologici, è stato sviluppato un sistema di monitoraggio software per l’analisi in tempo reale di accelerazione, frequenza e temperatura. Tale analisi ha rivelato la presenza di componenti armoniche indeside rate, risonanze strutturali e variazioni dell’accelerazione durante la prova, attribuibili a limita zioni meccaniche del setup iniziale. Sulla base di queste evidenze, è stata progettata una nuova piattaforma meccanica, successivamente valutata sia dal punto di vista strumentale, per caratte rizzare lo stimolo vibrazionale trasmesso alla piastra, sia mediante prove biologiche preliminari con saggio MTS, finalizzate a verificare la riproducibilità della risposta cellulare in condizioni di stimolazione più controllate.