Development of a CDC Biofilm Reactor Assay for Investigating Biofilm Formation by Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC)

Biofilms are bacterial communities embedded in a self-produced extracellular matrix, which allows bacterial growth and adhesion on both biotic and abiotic surfaces. This matrix confers enhanced tolerance to environmental stresses, disinfectants and antimicrobials, making biofilms hard to remove and contributing to the spread of antimicrobial resistance. These features make biofilm contamination a major concern in clinical, veterinary, and industrial settings. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is one of the main bacterial pathogens affecting poultry, responsible for significant economic losses worldwide. The ability of APEC strains to form biofilms may contribute to bacterial persistence in the farm environment, particularly within drinking water distribution systems, representing thus a potential source of infection for the birds. Furthermore, this phenotypic property may contribute to disease development in birds by contributing to the virulence of APEC strains. This study aimed to develop and optimize a protocol using a CDC Biofilm Reactor (CBR) to investigate biofilm formation by APEC strains under dynamic flow conditions, thereby mimicking the drinking water distribution systems used in poultry farms. Before evaluating biofilm formation under dynamic flow conditions, the biofilm recovery procedure was optimized in batch mode by comparing different collection methods. Following the identification of the most effective recovery procedure, the experimental protocol was established. The standard operating flow rate of the CBR was set at 4 ml/min. The strains were also tested in batch mode and under a reduced flow rate of 2 ml/min, corresponding to half of the standard flow rate. Biofilm formation was quantified by optical density (OD) measurement. The results obtained in dynamic flow conditions were also compared with those previously obtained testing the same strains in a static assay, where biofilm grew without continuous nutrient supply. Understanding the environmental conditions that promote biofilm formation by APEC is essential for identifying the factors that favour bacterial persistence within poultry drinking water systems. In this context, the implementation of the CBR dynamic flow assay provides a reliable and reproducible in vitro model for investigating the environmental factors involved in APEC biofilm formation.

I biofilm sono comunità batteriche inglobate in una matrice extracellulare autoprodotta, che consente la crescita e l'adesione dei batteri sia su superfici biotiche sia abiotiche. Questa matrice conferisce una maggiore tolleranza agli stress ambientali, ai disinfettanti e agli antimicrobici, rendendo i biofilm difficili da rimuovere e contribuendo alla diffusione della resistenza agli antimicrobici. Queste caratteristiche rendono la contaminazione da biofilm una delle principali problematiche in ambito clinico, veterinario e industriale. L'Escherichia coli patogeno aviario (APEC) è uno dei principali patogeni batterici che colpiscono il pollame, causando ingenti perdite economiche a livello mondiale. La capacità dei ceppi APEC di formare biofilm può contribuire alla persistenza del batterio nell'ambiente di allevamento, in particolare all'interno dei sistemi di distribuzione dell'acqua di abbeverata, rappresentando quindi una potenziale fonte di infezione per gli animali. Inoltre, questa proprietà fenotipica può favorire lo sviluppo della malattia negli uccelli contribuendo alla virulenza dei ceppi APEC. Questo studio ha avuto l'obiettivo di sviluppare e ottimizzare un protocollo basato sul CDC Biofilm Reactor (CBR) per studiare la formazione di biofilm da parte di ceppi APEC in condizioni di flusso dinamico, riproducendo così i sistemi di distribuzione dell'acqua di abbeverata utilizzati negli allevamenti avicoli. Prima di valutare la formazione del biofilm in condizioni di flusso dinamico, la procedura di recupero del biofilm è stata ottimizzata in modalità batch confrontando diversi metodi di raccolta. Una volta identificata la procedura di recupero più efficace, è stato definito il protocollo sperimentale. La portata operativa standard del CBR è stata impostata a 4 ml/min. I ceppi sono stati inoltre testati in modalità batch e in condizioni di flusso ridotto pari a 2 ml/min, corrispondente alla metà della portata standard. La formazione del biofilm è stata quantificata mediante misurazione della densità ottica (OD). I risultati ottenuti in condizioni di flusso dinamico sono stati inoltre confrontati con quelli precedentemente ottenuti valutando gli stessi ceppi mediante un saggio in condizioni statiche, nelle quali il biofilm si sviluppava in assenza di un apporto continuo di nutrienti. Comprendere le condizioni ambientali che promuovono la formazione di biofilm da parte dei ceppi APEC è essenziale per identificare i fattori che ne favoriscono la persistenza all'interno dei sistemi di distribuzione dell'acqua di abbeverata negli allevamenti avicoli. In questo contesto, l'implementazione del saggio in flusso dinamico mediante CBR fornisce un modello in vitro affidabile e riproducibile per studiare i fattori ambientali coinvolti nella formazione del biofilm da parte di APEC.