La protein chinasi CK2 regola le modifiche epigenetiche nei linfociti B del centro germinativo sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

Introduction and Aim. Epigenetic events regulate accessibility of transcription factors to regulatory regions, thus activating or repressing transcriptional programs. Moreover, B lymphocytes, during their maturation process, require fine coordination of epigenetic and transcription mechanisms. To note, it is clearly established that epigenetic deregulation is associated with several hematological malignances. Protein CK2 is a Ser/Thr pleiotropic kinase that has gained notoriety for its ability in promoting cell survival and proliferation and it results overexpressed in several solid and hematologic tumors. Our group has previously demonstrated the importance of CK2 also in B cell destiny, where it supports germinal center establishment and plasma cell generation, also through the positive modulation of key transcription factors such as BCL6 and IRF4. Although CK2 was demonstrated to phosphorylate some players of epigenetic modifications, its direct involvement in the potential control of epigenetic events in B cell terminal maturation has not been investigated yet. Thus, the aim of this thesis was to evaluate the effects of chemical inhibition of CK2 on acetylation and methylation status of histones, on epigenetic regulators and on proteins involved in Acetyl-CoA production (such as ATP citrate lyase-ACLY) both in normal and pathological B cells. Methods. VAV-BCL2 mice were chosen as pathological mouse models of follicular lymphoma. Both healthy (wild-type WT) and VAV-BCL2 mice were characterized at flow cytometry level, and B lymphocytes were purified from their spleens; B cells were analyzed at time zero and after in vitro differentiation towards GC and plasmablasts induced by anti-CD40 and IL-4 treatment in presence or absence of CK2 inhibition. Cell lysates were used to determine protein expression and to perform enzymatic activity assays. Moreover, histone deacetylase HDAC1 and HDAC2 localizations were investigated by immunofluorescence. Results. This thesis demonstrates in differentiating normal B cells, that CK2 inhibition reduces acetylation of histone H3 in lysine 27 (H3K27ac) and the pan-acetylation of histone H4 (panH4ac); in the meantime, there was the increase of the tri-methylation of histone H3 in lysine K27 (H3K27me3), indicating an overall transcriptional inactivation. VAV-BCL2 pathological B lymphocytes presented basal lower amount of histone acetyltransferase CREB binding protein (CBP/P300) and higher levels of CK2α, HDAC1, EZH2 and of H3K27me3 when compared to WT cells; they showed further increase in methylation upon CK2 blockade without significant changes in acetylation. In both normal and pathological lymphocytes CK2 inhibitors impaired ACLY enzyme expression and activation. Moreover, these treatments reduced CBP/P300 amounts, HDAC2 phosphorylation and HDAC1 total levels, altering cell localization of the latter. VAV-BCL2 B cells showed a trend of higher basal activity for HDACs compared to WT samples and a trend of decrease after induction of differentiation in presence of CX-4945. Concluding, CK2 is involved in epigenetic regulation in B lymphocytes both at basal level and during differentiation with small differences in CK2-inhibition effects between healthy samples and pathological ones. These data could open new therapeutical approaches targeting selectively this kinase.

Introduzione e scopo. L’epigenetica regola l’accessibilità dei fattori di trascrizione alle sequenze regolatorie dei geni, attivando o reprimendo i programmi trascrizionali. Anche i linfociti B per attuare la loro maturazione richiedono un fine coordinamento tra modifiche epigenetiche e processi trascrizionali. Inoltre, è noto che la deregolazione epigenetica è associata a diverse tipologie di neoplasie ematologiche. La proteina CK2 è una Ser/Thr chinasi pleiotropica nota per promuovere sia la sopravvivenza che la proliferazione cellulare e non a caso risulta sovraespressa in molteplici tumori solidi ed ematologici. Il nostro gruppo ha dimostrato in precedenza l’importanza di CK2 anche nel commitment terminale delle cellule B dove supporta il consolidamento dei centri germinativi e la formazione delle plasmacellule anche grazie alla regolazione positiva di fattori trascrizionali come BCL6 e IRF4. Sebbene CK2 fosforili modulatori dell’epigenetica, il suo coinvolgimento diretto nel controllo dei cambiamenti epigenetici nelle fasi terminali del differenziamento linfoide B non è ancora stato studiato. Dunque, lo scopo di questo elaborato è stato di valutare gli effetti dell’inibizione chimica di CK2 sull’acetilazione e metilazione degli istoni, sulle proteine regolatrici dell’epigenetica e sugli enzimi coinvolti nella produzione di Acetyl-CoA (ATP citrato liasi-ACLY) sia nei linfociti B normali che patologici. Metodi. Come modello patologico di linfoma follicolare sono stati impiegati i topi VAV-BCL2. Sia i topi sani (wild-type WT) che VAV-BCL2 sono stati caratterizzati a livello citofluorimetrico e i linfociti B purificati dalle milze. Tali cellule sono state analizzate al tempo zero e dopo differenziamento verso cellule B del centro germinativo (GC) e plasmablasti mediante trattamento con anti-CD40 e IL-4, in presenza o assenza di inibitori di CK2. I lisati cellulari sono stati utilizzati per valutare l’espressione proteica e per eseguire saggi di attività enzimatica. L’immunofluorescenza è stata impiegata per studiare la localizzazione intracellulare delle istone deacetilasi HDAC1 ed HDAC2. Risultati. In questo elaborato si dimostra che in fase di differenziamento dei linfociti B normali, l’inibizione di CK2 riduce l’acetilazione dell’istone H3 in lisina 27 (H3K27ac) e della pan-acetilazione dell’istone H4 (panH4ac); al contempo si ha un aumento della tri-metilazione dell’istone H3 in lisina 27 (H3K27me3), indicando una complessiva inattivazione trascrizionale. I linfociti B patologici dei topi VAV-BCL2 presentano in condizioni basali una quota ridotta della istone acetiltransferasi CBP/P300 e livelli più elevati di CK2, EZH2, HDAC1 e di metilazione nell’ istone H3 in confronto ai WT; tali campioni hanno evidenziato un ulteriore aumento della metilazione H3K27me3 dopo blocco di CK2 senza cambiamenti significativi dell’acetilazione. Sia nelle cellule B normali che patologiche, l’inibizione di CK2 compromette l’espressione di ACLY e la sua attivazione. Inoltre, questi trattamenti portano alla riduzione di espressione di CBP/P300, della fosforilazione di HDAC2 e dei livelli totali di HDAC1, alterando la localizzazione cellulare di quest’ultimo. Le cellule B portatrici del costrutto VAV-BCL2 hanno mostrato un trend di attività più elevata per le HDACs se confrontate con le WT ed un trend di riduzione dopo trattamento con CX-4945. Concludendo, CK2 risulta coinvolto nella regolazione epigenetica nei linfociti B sia in condizioni basali che durante il differenziamento e la sua inibizione ha mostrato piccole differenze d’impatto tra campioni sani e patologici. Questi dati potrebbero aprire la strada verso nuovi approcci terapeutici che colpiscono selettivamente questa chinasi.