Mucosal-associated invariant T (MAIT) cells produce growth factors and influence the regeneration of hepatic spheroids

Background: The liver is an important immunological site which receives bacterial products, toxins and various antigens from the gastrointestinal tract. To play an effective role in defense, the liver relies primarily on a robust innate immune system and the results are not only crucial for the response against microorganisms but also in liver injury and repair. One immune population is particularly enriched in the liver: Mucosal-associated invariant T cells (MAIT), which represent up to 50% of all the resident T- cells in the organ and seem to play complex roles in different liver diseases, including alcoholic liver disease, non-alcoholic liver disease, autoimmune liver diseases, viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. MAIT cells are an unconventional T cell population characterised by a semi-invariant TCR-α chain (made of an invariant Vα7.2-Jα33 in humans) and can recognise a highly conserved antigen derived from the microbial riboflavin synthesis pathway presented by MR1. MAIT cells can be activated through TCR-dependent and TCR-independent pathways, and they can also be triggered by a synergy of these two mechanisms, leading to a potent anti-microbial response. Different activation pathways lead to the expression of distinct effector programs. In addition to the more studied anti-microbial and inflammatory functions, growing evidence shows a potential role in tissue repair. Purpose of the study: Given the abundance of MAIT cells in the liver and their emerging role in tissue repair, we hypothesised that MAIT cells might play a role in liver regeneration. We set up a model based on hepatic spheroids to investigate their effective involvement. Materials and methods: Here, we used flow cytometry to examine the effect of combinations of TCR-dependent and TCR-independent signals in human MAIT cells on the production of tissue-repair associated factors. We then analysed the effect of MAIT-derived supernatants on trypsinized hepatic spheroids as models for liver injury. To explore the regeneration of the spheroids, we analysed by qPCR the gene expression of CLDN1, CLDN4 and CD44, three proteins associated with formation and repair of hepatic spheroids, at different time-points. We compared the results with untreated spheroids as negative control. Results: We validated that TCR-dependent triggering of MAIT- cells promotes a tissue-repair program through the production of several factors like GM-CSF, M-CSF, PDGFAA, PDGF-BB, TGF-α and EPO. This upregulation is maximized by combined stimulation. Moreover, the analysis of tissue-repair associated factors production in sorted MAIT cells allowed us to confirm that MAIT cells are directly involved in the upregulation of VEGF, GM-CSF and PDGFAA. Finally, the in-vitro assay based on hepatic spheroids showed that the addition of activated MAIT cells-derived supernatants can induce an earlier and increased gene expression of CD44, a cell adhesion molecule associated to spheroids formation and regeneration. Conclusions: Altogether, these elements confirm the potential role of MAIT cells in tissue repair and open up possibilities for the function of these cells in the liver.

Contesto: Il fegato è un importante sito immunologico che riceve prodotti batterici, tossine e antigeni di varia natura dal tratto gastrointestinale. Per operare una difesa efficace si basa principalmente su un solido sistema immunitario innato e il risultato è rilevante non solo per la risposta contro diversi micro-organismi, ma anche in caso di danno epatico e riparazione. Una sottopopolazione del sistema immunitario è particolarmente abbondante nel fegato: le cellule T invarianti associati alla mucosa (MAIT). Rappresentano fino al 50% di tutti i linfociti T residenti e svolgono ruoli complessi in diverse patologie epatiche tra cui epatite alcolica, epatite autoimmune, epatiti virali e carcinoma epatocellulare. Le cellule MAIT sono cellule T non convenzionali caratterizzate da una catena alfa recettore semi-invariante (costituita da Vα7.2-Jα33 negli umani) e riconoscono metaboliti della sintesi della riboflavina presentati da MR1. Queste cellule possono essere attivate in maniera TCR-dipendente e TCR-indipendente, inoltre possono essere stimolate da una combinazione dei due meccanismi, inducendo una potente risposta alle infezioni. La modalità di attivazione influenza il programma di trascrizione di determinati geni, quindi modelli di attivazione diversi inducono risposte differenti. In aggiunta alle note funzioni anti-microbiche e relative all’infiammazione, recenti ricerche hanno messo in luce una potenziale attività di riparazione tissutale. Scopo dello studio: Data l’abbondanza delle cellule MAIT nel fegato e le recenti evidenze circa un ruolo nella riparazione tissutale, abbiamo ipotizzato che queste cellule potessero essere coinvolte nella rigenerazione epatica. Abbiamo quindi realizzato un modello basato su sferoidi epatici per studiare l’effettivo coinvolgimento delle cellule MAIT nella loro riparazione. Materiali e metodi: In questo studio abbiamo esaminato attraverso citometria di flusso la produzione di fattori associati alla riparazione tissutale da parte delle cellule MAIT in seguito a diversi tipi di stimolazione. Inoltre abbiamo studiato l’effetto di supernatanti derivati da cellule MAIT attivate sulla rigenerazione di sferoidi epatici, come modello per simulare un danno al fegato. Per valutare la riparazione abbiamo analizzato attraverso qPCR l’espressione genica di CLDN1, CLDN4 e CD44, tre proteine associate alla formazione e alla rigenerazione di sferoidi epatici, a diversi time-point. Abbiamo confrontato i risultati con sferoidi epatici non trattati come controllo negativo. Risultati: Abbiamo dimostrato che la stimolazione via TCR, soprattutto se supportata da stimolazione TCR-indipendente, induce le cellule MAIT a produrre diversi fattori tra cui GM-CSF, M-CSF, PDGFAA, PDGF-BB, TGF-α e EPO. Il sorting di cellule MAIT ci ha inoltre permesso di dimostrare un ruolo diretto nella produzione di PDGFAA, VEGF e GM-CSF. Infine, l’analisi del modello in-vitro di danno epatico ha evidenziato che l’aggiunta di supernatanti derivati da cellule MAIT attivate induce una più precoce e aumentata espressione genica di CD44, una molecola di adesione intercellulare associata alla formazione e rigenerazione di sferoidi. Conclusione: Insieme, questi elementi confermano il potenziale ruolo delle cellule MAIT nella riparazione tissutale e aprono le porte a ulteriori ricerche riguardo a questa attività a livello epatico.