Il microambiente immunosoppressivo nel B-NHL pediatrico

Background: The Non-Hodgkin Lymphoma (NHL), a malignant tumor of the hematopoietic system, represents 6% of all tumors in pediatric patients. Within the standard protocols, nearly 70% of all patients maintain remission for 5 years; however, pediatric patients, who are relapsing or refractory to conventional chemotherapy, have poor survival rate: less than 20%. Crucial determinants for the failure of second and third-line therapeutic strategies are immunosuppressive mechanisms coordinated in the host by the immunosuppressive tumor microenvironment. Project purpose: The aim of this project is to characterize the phenotype, function and metabolic profile of the cells belonging to the myeloid suppressive compartment, in particular of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and Tumor Associated Macrophages (TAM), that interact in the pediatric B-NHL microenvironment. Materials and methods: To this purpose, peripheral blood and bone marrow samples from pediatric DLBCL patients have been processed for the ex vivo characterization by flow cytometry. Differentiation protocols to generate in vitro MDSC and TAM from mononuclear blood cells have been developed; we carried out the phenotype analysis by FACS, the functional evaluation in RT-qPCR and the metabolomic analysis by mass spectrometry. The latter study has been performed thanks to the ongoing collaboration with Prof. Alessandra Castegna, Metabolic Unit of the University of Bari. Results: Preliminary ex vivo characterization by FACS analysis, suggested that PMN-MDSC are expanded in pediatric B-NHL samples. We worked to develop a protocol to differentiate in vitro MDSC, in particular the PMN-MDSC cell subsets. Finally, the metabolomic analysis revealed that, among the metabolic pathways, the arginine and glutamine metabolism, in addition to the succinate and itaconate metabolism are relevant pathways in the in vitro generation of MDSC. Conclusions: Although still preliminary, our results suggest that distinct MDSC subsets are differentially expanded in the pediatric B-NHL tumor microenvironment. Additional analysis in a larger cohort will be require to provide novel insights into the mechanisms orchestrating cancer immune evasion in pediatric NHL patients.

Presupposti del progetto: Il linfoma non Hodgkin o Non-Hodgkin Lymphoma (NHL), tumore maligno dell’apparato emolinfopoietico, rappresenta il 6% di tutti i tumori nella fascia di età pediatrica. Con i protocolli terapeutici attuali circa il 70% dei pazienti mantiene la remissione a 5 anni; tuttavia, i pazienti pediatrici refrattari o recidivanti alla chemioterapia convenzionale, hanno tassi di sopravvivenza inferiori al 20%. Tra le principali cause di fallimento terapeutico alle strategie di seconda e terza linea ci sono meccanismi di evasione della risposta immunitaria coordinati dal microambiente tumorale immunosoppressivo. Scopo del progetto: Lo scopo di questo progetto di tesi è quindi quello di caratterizzare il fenotipo, la funzione ed il profilo metabolico delle cellule appartenenti al compartimento mieloide immunosoppressivo, in particolar modo delle cellule mieloidi soppressorie o Myeloid Derived Suppressors Cells (MDSC) e dei macrofagi associati al tumore o Tumor Associated Macrophages (TAM), attive nel microambiente del B-NHL pediatrico. Materiali e metodi: Per condurre queste analisi, campioni di sangue periferico e di midollo osseo di DLBCL pediatrico sono stati processati per la caratterizzazione ex vivo mediante citofluorimetria di flusso. Successivamente sono stati condotti esperimenti di differenziamento di cellule mononucleate, ottenute da prelievo ematico di donatori sani, in MDSC e TAM, che sono poi state caratterizzate mediante FACS e RT-qPCR. Al contempo è stato seguito un protocollo di differenziamento in MDSC di cellule staminali ematopoietiche CD34+ di donatori sani; quindi è stata condotta, terminato il processo, l’analisi di fenotipo mediante FACS, l’analisi funzionale mediante RT-qPCR e lo studio di metabolomica mediante spettrometria di massa. Quest’ultimo è stato approfondito grazie alla collaborazione con la Prof.ssa Alessandra Castegna, dell’Unità di Metabolomica dell’Università di Bari. Risultati: La caratterizzazione ex vivo mediante FACS ha quindi permesso di osservare come le cellule del compartimento mieloide immunosoppressivo più rappresentate, nei campioni di DLBCL dei pazienti pediatrici, siano le polymorphonuclear-MDSC (PMN-MDSC), ovvero MDSC con fenotipo neutrofilico, mentre meno le monocytic-MDSC (M-MDSC), ovvero MDSC con fenotipo monocitico; con queste ultime più rappresentate nell’adulto. La caratterizzazione in vitro mediante FACS e RT-qPCR di MDSC e TAM ha permesso di selezionare protocolli che permettano il differenziamento nel cluster di cellule tollerogeniche più rappresentato nei campioni dei pazienti, così da poter condurre poi studi e saggi farmacologici su questa sottopopolazione. Infine, lo studio di metabolomica ha permesso di evidenziare come, tra le vie metaboliche maggiormente implicate nel ciclo biologico delle MDSC differenziate con GM-CSF nitrato, risulta esservi il metabolismo di arginina e glutammina, oltre che, a livello del ciclo degli acidi tricarbossilici, quello di succinato e itaconato. Conclusioni: Il contributo delle analisi e dei risultati conseguiti in questo progetto di tesi equivale ad una descrizione base di alcune componenti cellulari chiave attive nel microambiente tumorale del B-NHL pediatrico. Sono in ogni caso necessari ulteriori approfondimenti, al fine di confermare i risultati ottenuti, quindi identificare potenziali target terapeutici alternativi per la cura dei casi di B-NHL pediatrico recidivanti o refrattari.