Characterization and clinical correlates of extracellular vesicles in idiopathic inflammatory myopathies: data from a monocentric cohort

Background: Idiopathic inflammatory myopathies (IIM) are a heterogeneous group of rare autoimmune diseases for which few options of disease markers are available to date. Extracellular vesicles (EV) are ubiquitous subcellular nanoparticles that engage in cell-to-cell signaling and have been recently discovered to be altered in several autoimmune conditions: their role in IIM is still unclear. Aim of the Study: This study aimed at characterizing the circulating EV pool and exploring EV potential as a disease and treatment biomarker in the context of IIM. Specifically, we aimed at developing an innovative and reliable methodology for the isolation and characterization of plasma EV and at investigating correlates between features of circulating EV and clinical and laboratory parameters of IIM patients. Patients and Methods: This single-center observational study included adult (≥18 years old) IIM patients consecutively followed-up at the Rheumatology Unit of Padua University Hospital and age- and sex-matched healthy donors (HD). IIM diagnosis was performed by an experienced rheumatologist on clinical, laboratory and histology data. Upon obtainment of informed consent, a 5 ml whole blood sample was collected in sodium-citrate tubes from every participant. EV were isolated through size exclusion chromatography (SEC) and subsequent ultrafiltration; particle morphology was observed via transmission electron microscopy (TEM). Nanoparticle tracking analysis (NTA) was performed to evaluate the concentration and size of EV. The characterization of EV surface markers was conducted through imaging flow cytometry (IFC). Clinical and laboratory data were retrieved from the intra-hospital network health records. Data were analyzed in a cross-sectional fashion; parametric Student-t test and one-way ANOVA with Bonferroni correction tests were used for comparisons. Results: We included 45 IIM patients (F:M ratio 1.8:1; mean age±SD 60.0±12.7 years) and 45 age and sex-matched HD (F:M ratio 3:1; mean age±SD 56.6±14.2 years). Fourteen patients (31.1%) were affected with dermatomyositis; 8 with polymyositis (17.8%); 2 with inclusion body myositis (4.4%); 8 with cancer-associated myositis (CAM,17.8%); 12 with anti-synthetase syndrome (22.2%); 3 with unspecified myositis (6.7%). Isolated EV concentrations reached ~1010 EV/mL at NTA. TEM images confirmed the intact and roundish morphology of EV and IFC highlighted expression of EV specific surface markers. IIM patients displayed significantly increased EV concentrations compared to healthy controls (1.95×1010±1.47×1010 vs 1.45×1010±7.82×109; p=0.025). Interstitial lung disease (ILD) or CAM was associated with significantly higher EV concentrations compared to HD only or to HD and non-CAM patients, respectively (ILD vs HD:2.12×1010±1.61×1010 vs 1.45×1010±0.78×1010, p=0.021; CAM vs non-CAM:3.28×1010±2.84×1010 vs 1.67×1010±7.7×109, p=0.004; CAM vs HD:3.28×1010±2.84×1010 vs 1.45×1010±0.78×1010, p<0.001). Moreover, EV concentrations were significantly higher in patients with a disease duration of less than 6 months (3.20×1010±2.42×1010 vs 1.80×1010±1.80×1010; p=0.042) and in treatment-naïve patients compared to HD (2.83×1010±2.89×1010 vs 1.45×1010±0.78×1010; p=0.010) which tended to be numerically decreased in IIM patients undergoing immunosuppressive treatment. Seropositive patients showed numerically increased levels of circulating EV. Conclusions: Our study supports the reliability of the protocol exploited for the isolation and characterization of plasma EV both in IIM patients and in HD. We show that IIM patients display significantly increased concentrations of circulating EV compared to HD, especially in recent-onset, seropositive and treatment-naïve patients thereby substantiating the role of plasma EV as a potential biomarker in the surveillance of IIM patients.

Premesse:Le miopatie infiammatorie idiopatiche (IIM) sono un gruppo eterogeneo di malattie autoimmuni rare per cui ad oggi vi è scarsità di biomarker.Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle ubiquitarie implicate nel signaling intercellulare recentemente scoperte alterate in diverse condizioni autoimmuni:il loro ruolo nelle IIM non è ancora chiaro. Obiettivi:Lo studio mira a caratterizzare il pool di EV circolanti ed esplorare il loro potenziale come biomarker di malattia e trattamento nelle IIM. Intendiamo sviluppare un metodo innovativo ed affidabile per l'isolamento e la caratterizzazione delle EV plasmatiche e indagarne le correlazioni con i parametri clinici e di laboratorio dei pazienti affetti da IIM. Metodi:Questo studio osservazionale monocentrico include pazienti adulti(≥18 anni) affetti da IIM in FUP presso l'UOC di Reumatologia dell'Azienda Ospedaliera di Padova e donatori sani(HD) appaiati per età e sesso.La diagnosi di IIM è stata effettuata da un reumatologo esperto sulla base di dati clinici,di laboratorio e istologici.Previo consenso informato, è stato prelevato un campione da 5ml di sangue intero da ogni soggetto.Le EV sono state isolate mediante cromatografia ad esclusione dimensionale(SEC) e successiva ultrafiltrazione;la morfologia delle particelle è stata osservata tramite microscopia elettronica a trasmissione(TEM).L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle(NTA) è stata eseguita per valutare concentrazione e dimensioni delle EV.La caratterizzazione dei marcatori di superficie delle EV è stata condotta tramite citofluorimetria(IFC).I dati clinici e di laboratorio sono stati ottenuti dalle cartelle cliniche della rete intraospedaliera. I dati sono stati analizzati trasversalmente; per i confronti sono stati usati i test parametrici t di Student e onewayANOVA con correzione di Bonferroni. Risultati:Sono stati inclusi 45pazienti con IIM(rapporto F/M 1,8:1;età media±DS 60,0±12,7 anni) e 45 HD appaiati per età e sesso(rapporto F/M 3:1;età media±DS 56,6±14,2 anni).Quattordici pazienti(31,1%) erano affetti da dermatomiosite;8 da polimiosite(17,8%);2 da miosite a corpi inclusi(4,4%);8 da miosite associata al cancro(CAM,17,8%);12 da sindrome antisintetasi(22,2%);3 da miosite nonspecificata(6,7%).Le concentrazioni delle EV isolate hanno raggiunto~1010 EV/mL al NTA. Le immagini TEM hanno confermato la morfologia intatta e tondeggiante delle EV e l'IFC ha evidenziato l'espressione dei marker di superficie delle EV. I pazienti affetti da IIM hanno mostrato concentrazioni di EV significativamente maggiori rispetto ai controlli sani (1,95×1010±1.47×1010vs1.45×1010±7.82×109,p=0,025).La presenza di interstiziopatia polmonare(ILD) o CAM correlava con livelli di EV significativamente più elevati rispetto ai HD o rispetto a HD e pazienti non-CAM, rispettivamente(ILD vs HD:2,12×1010±1,61×1010vs1,45×1010±0,78×1010,p=0,021;CAM vs nonCAM:3,28×1010±2,84×1010vs1,67×1010±7,7×109,p=0,004).Inoltre, le concentrazioni di EV erano significativamente più alte nei pazienti con breve (≤6 mesi) durata di malattia (3,20×1010±2,42×1010vs1,80×1010±1,80×1010;p=0,042)e nei pazienti naïve al trattamento rispetto ai HD (2,83×1010±2,89×1010vs1,45×1010±0.78×1010;p=0,010).Minori differenze sono state registrate tra pazienti trattati e HD.I pazienti sieropositivi hanno mostrato livelli numericamente maggiori di EV circolanti. Conclusioni:Il nostro studio supporta l'affidabilità e la validità del protocollo adottato per l'isolamento e la caratterizzazione delle EV plasmatiche sia nei pazienti affetti da IIM che nei controlli sani. Abbiamo dimostrato che i pazienti affetti da IIM presentano concentrazioni significativamente maggiori di EV circolanti rispetto ai controlli sani, soprattutto nei pazienti di recente insorgenza, sieropositivi e naïve al trattamento avvalorando così il ruolo delle EV plasmatiche come potenziali biomarker nel monitoraggio dei pazienti affetti da IIM.