Modello di zebrafish di micosi fungoide

Background Mycosis fungoides (MF) is the most recurrent form of primary cutaneous T-cell lymphoma. It is characterized by an idle clinical onset and by the progression through the three different stages of tumour patches, plaques, and nodules. The treatment of early stages of the disease occurs through topical therapies, which have reported positive results, while the treatment of advanced stages involves systemic or combined therapies which have to this day demonstrated poor prognoses. Objectives The core purpose of this study is the development of the first experimental zebrafish model of mycosis fungoides by introducing, through xenografting, human cutaneous lymphoma cells MyLa CD4+ into zebrafish embryos on day two following fertilization. The parameter used to assess the effectiveness of engraftment and proliferation of cancer cells was global mortality. An additional secondary objective was included, in which the aim was to determine the variation in mortality starting from a number of different transplanted cells. Materials and methods The mycosis fungoides cell line known as MyLa CD4+, purchased by Sigma-Aldrich (Catalog N° 95051032), was initially transfected, by electroporation technique, with the DNA plasmid pMax-GFP, specially made for eukaryotic expression and purchased by biotechnology company Amaxa in such a way as to make these cells express a fluorescent green protein and therefore be distinguishable from the zebrafish’s own cells. Once the alteration had been verified, the cells were deposited in the centre of the yolk of each zebrafish embryo on day 2 post-fertilization by means of microinjection. For the purpose of this study, day two post-fertilization zebrafish were divided into two groups in which the mortality was assessed during a four-day timeframe. The control group, i.e. the one in which no transplant was performed, was made up of four subgroups, for a total of 85 fish; the transplanted group also consisted of four subgroups, for a total of 61 fish (of which 48 transplanted with 100-200 cells and 13 transplanted with <10 cells). Results The day four mortality parameter following engraftment (six days after fertilization) for the control group was 4/85, resulting in an overall mortality of 4.7%, while the transplanted group presented a mortality of 44/48, with an overall mortality of 91.7%, thus representing a significant difference between the two groups. The transplanted batch with <10 cells had a number of deaths equal to 5/13, with a calculated mortality rate of 38.5%. The mortality rates of the transplanted batches were compared with the control group, using the Chi-square statistical test, showing a statistically significant difference. Conclusions The xenotransplantation experiments performed to evaluate the proliferation of mycosis fungoides cells in zebrafish embryos have given very positive and extremely encouraging results, confirming the possible use of this animal species as a model for the study of this pathology. The cell implantation has therefore provided an excellent response and the cancer cells have demonstrated a remarkable adaptation within the embryonic microenvironment to the point of having a very high proliferative rate, resulting in the ability to lead to the death of embryos with extraordinary speed. This demonstrates that this model can be used in the future to evaluate the effectiveness of innovative methods, such as photoimmunotherapy or to comprehend the serviceability of specific monoclonal antibodies against cancer cells, evaluating the decrease of mortality or a improvement of the mean survival of zebrafish embryos.

Presupposti dello studio La micosi fungoide (MF) è la forma di linfoma primitivo cutaneo a cellule T più frequente, caratterizzata da un decorso clinico indolente e dalla progressione attraverso i tre diversi stadi di chiazza, placca e nodulo tumorale. Il trattamento degli stadi iniziali della patologia avviene mediante terapie topiche, con buoni risultati, mentre la cura degli stadi avanzati prevede terapie sistemiche o combinate con prognosi ad oggi infausta. Scopo dello studio L’obiettivo principale di questo studio è la realizzazione del primo modello sperimentale di zebrafish di micosi fungoide, attraverso lo xenotrapianto di cellule di linfoma cutaneo umane MyLa CD4+ in embrioni di zebrafish al secondo giorno post fecondazione. Il parametro utilizzato per verificare l’efficacia dell’attecchimento e l’effettiva proliferazione delle cellule neoplastiche è la mortalità globale. L’obiettivo secondario è invece stato quello di determinare la variazione di mortalità partendo da un numero di cellule trapiantate differenti. Materiali e Metodi La linea cellulare di micosi fungoide denominata MyLa CD4+, acquistata dalla ditta Sigma-Aldrich (N° catalogo 95051032) è stata per prima cosa trasfettata, mediante tecnica di elettroporazione, con un plasmide a DNA pMax-GFP, realizzato appositamente per l’espressione eucariotica e acquistato dalla compagnia biotecnologica Amaxa in modo tale da far esprimere a queste cellule una proteina verde fluorescente e differenziarle dalle cellule proprie dello zebrafish. Le cellule, una volta verificata l’avvenuta modifica, sono state depositate al centro del tuorlo di ogni embrione di zebrafish a 2 giorni post-fecondazione mediante una metodica di micro-iniezione. Ai fini dello studio, gli zebrafish sono stati divisi in due gruppi e ne è stata valutata la mortalità per quattro giorni. Il gruppo di controllo, ovverosia quello in cui non è stato effettuato alcun trapianto, è composto da quattro lotti, per un totale di 85 embrioni; il gruppo trapiantato è composto anch’esso da quattro lotti, per un totale di 61 embrioni (di cui 48 trapiantati con 100-200 cellule e 13 trapiantati con <10 cellule). Risultati La mortalità a quattro giorni post-trapianto (sei giorni post-fertilizzazione) per il gruppo di controllo è stata di 4/85 ottenendo una mortalità globale del 4,7%, mentre per il gruppo trapiantato con 100-200 cellule si è ottenuta una mortalità di 44/48, con una mortalità globale del 91,7%. Il lotto trapiantato con <10 cellule ha avuto un numero di decessi pari a 5/13 con una mortalità calcolata del 38,5%. Le mortalità dei lotti trapiantati sono state messe a confronto con il gruppo di controllo, utilizzando il test statistico Chi-quadrato, denotando una differenza statisticamente significativa. Conclusioni Gli esperimenti di xenotrapianto eseguiti per valutare la proliferazione di cellule di micosi fungoide in embrioni di zebrafish hanno dato risultati molto positivi ed estremamente incoraggianti, confermando il possibile utilizzo di questa specie animale come modello per lo studio della patologia. L’impianto cellulare ha perciò fornito un’ottima risposta e le cellule tumorali hanno dimostrato un notevole adattamento all’interno del microambiente embrionale al punto da possedere un elevatissimo tasso proliferativo, risultando in grado di portare alla morte degli embrioni con straordinaria velocità. In ottica futura, quindi, questo modello potrà essere utilizzato per la valutazione dell’efficacia di metodiche innovative, come la fotoimmunoterapia o al fine di comprendere l’utilizzabilità di anticorpi monoclonali specifici contro le cellule tumorali, valutando caso per caso la riduzione della mortalità o un allungamento della sopravvivenza media degli embrioni di zebrafish.