BACKGROUND Acute myeloid leukemia (AML) treatment remains a challenge mainly due to its genetic heterogeneity and biological complexity. In particular, refractory and relapsing forms are the main cause of mortality related to this pathology. From a pediatric perspective, AML did not achieve survival rates of lymphoblastic leukemia despite intensive chemotherapy protocols, large use of hematopoietic stem cell transplantation and supportive care improvements. Nowadays, the development of new therapies is still an unmet clinical need to improve AML survival. Numerous clinical trials and pre-clinical studies of new immunotherapy-based drugs are under development, with some of them either approved or being approved. Among the latter, six are based on CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T cells) technology, one of the forms of T-cell immunotherapy called adoptive cell transfer (ACT). CAR-T cells are engineered T cells ex vivo expressing a membrane receptor that combines the specificity of the variable component of immunoglobulins with the cytotoxic activity of T cells. Drugs currently in clinical use are specific for CD19 and BMCA antigens with indication for B cell neoplasms and multiple myeloma, respectively. AIM OF THE STUDY In this thesis, an innovative preclinical protocol has been applied for the development of second-generation CAR-T cells directed against two new antigens identified in AML blasts: CD-A and CD-D. In particular, two variable chains, G1 and H3, were tested directed against the first antigen and F12 and B8 against the second. T cells were analyzed for characteristics and immunophenotype and co-cultured with target AML cell lines to test lytic activity and specificity. In addition, the toxicity of constructs directed toward hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) has also been evaluated. MATHERIALS AND METHODS Each CAR cassette was cloned into a plasmid transfer to produce third-generation lentiviral vectors (LVs). T cells were isolated from healthy donors by gradient centrifugation of density and magnetic separation, activated and transduced with MOI of 10. Transduction efficiency was measured by ddPCR. After 14 days of expansion, T cells were cultured with SHI-1 and HL-60 target cell lines, and K562 and MOLM-13 cell lines, negative for CD-D and CD-A respectively, to assess specificity. After 48 hours of co-culture, mortality was measured by flow cytometry with Annexin V and 7-AAD, and by luciferase viability assay. Finally, toxicity was measured by colony-forming unit (CFU) count by metabolic assay with MTT. RESULTS CAR-T cells, effectively transduced and viable, had a predominantly CD4+ phenotype, with mainly central memory (Tcm), naive (Tn) and stem cell memory (Tscm) differentiation, with an expansion, on average, from 2 to 20 folds. Furthermore, the four chains did not affect the activation and exhaustion of CAR-T cells. In both assays, all chains showed lytic activity against the target cell lines. However, only the B8 and F12 constructs demonstrated specificity towards CD-D. Finally, these chains did not show toxicity HSPCs. CONCLUSIONS Results demonstrated that all ScFv chains have efficacy against AML blasts without toxicity towards stem cells. However, only CAR-T cells directed against the CD-D antigen showed a specific lysis. The main problem encountered in the use of this protocol was the expansion of CAR-T cells, which was below expectations. In conclusion, all four chains demonstrated a great potential for a novel immunotherapy approach.

INTRODUZIONE La leucemia acuta mieloide (LAM) rimane ancora oggi una sfida per quanto riguarda il trattamento. Inoltre, le forme refrattarie e recidivanti ne sono la causa principale di mortalità. Dal punto di vista pediatrico, la LAM non ha raggiunto la sopravvivenza della leucemia linfoblastica nonostante l’intensificazione della chemioterapia, l’uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche e il miglioramento della terapia di supporto. Lo sviluppo, quindi, di nuove cure è necessario per ottenere valide alternative al trattamento dei pazienti con LAM. Nuovi farmaci basati sull’immunoterapia sono in sviluppo, tra i quali sei sono basati sulla tecnologia CAR-T, una forma di immunoterapia a cellule T. Le cellule CAR-T sono linfociti T ingegnerizzati ex vivo esprimenti un recettore di membrana che combina la specificità della componente variabile delle immunoglobuline con l’attività citotossica dei linfociti T. I farmaci correntemente in uso clinico sono specifici per gli antigeni CD19 e BMCA con indicazione rispettivamente per neoplasie a cellule B e mieloma multiplo. SCOPO DELLO STUDIO In questo lavoro di tesi è stato applicato un protocollo preclinico innovativo per lo sviluppo di cellule CAR-T di seconda generazione dirette contro due nuovi antigeni identificati nei blasti di LAM: CD-A e CD-D. In particolare, sono state testate due catene variabili, G1 e H3, dirette contro il primo antigene e altre due, F12 e B8, contro il secondo. I linfociti T sono stati analizzati per caratteristiche e fenotipo e posti in coltura con linee cellulari di LAM per testare l’attività litica specifica. Inoltre, è stata anche valutata la tossicità dei costrutti nei confronti di cellule staminali ematopoietiche sane. MATERIALI E METODI Ogni cassetta con il costrutto CAR è stata clonata in un plasmide transfer per la produzione di vettori lentivirali (VL) di terza generazione. I linfociti T sono stati isolati da donatori sani tramite centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica, attivati e trasdotti con MOI di 10. L’efficienza di trasduzione è stata misurata tramite ddPCR. Dopo 14 giorni di espansione, i linfociti T sono stati caratterizzati per fenotipo, attivazione ed esaurimento e posti in coltura con le linee SHI-1 e HL-60, doppie positive per l’antigene, come target e le linee K562 e MOLM-13, rispettivamente negative per CD-D e CD-A, per valutare la specificità. Dopo 48 ore di co-cultura, la mortalità è stata misurata tramite citometria a flusso con Annessina V e 7-AAD, e tramite saggio di vitalità della luciferasi. Infine, la tossicità è stata misurata tramite la conta di unità formanti colonia (CFU) mediante saggio metabolico con MTT. RISULTATI Si è osservato che le cellule CAR-T, efficacemente trasdotte e vitali, presentano un fenotipo prevalentemente CD4+, con differenziazione prevalentemente central memory (Tcm), naive (Tn) e stem cell memory (Tscm). L'espansione, in media, va da 2 a 20 volte. Inoltre, si è dimostrato che le quattro catene non alterano l’attivazione e l’esaurimento delle cellule CAR-T. In entrambi i saggi, tutte le catene hanno evidenziato attività litica nei confronti delle linee target. Tuttavia, solo i costrutti B8 e F12 hanno presentato specificità nei confronti dell’antigene. Infine, si è osservato che tali catene non causano tossicità nei confronti di cellule staminali ematopoietiche sane. CONCLUSIONI I risultati hanno dimostrato che tutte le catene possiedono efficacia nei confronti dei blasti di LAM senza evidenziare tossicità nei confronti delle cellule staminali sane. Tuttavia, solo le cellule CAR-T dirette contro l’antigene CD-D hanno mostrato una lisi specifica. Il problema principale riscontrato nell’utilizzo di tale protocollo è stata l’espansione delle cellule CAR-T. In conclusione, si può affermare che tutti e quattro i CAR hanno dimostrato un grande potenziale per un innovativo approccio immunoterapico.

Early preclinical development of a CAR-T cell approach targeting novel antigens associated to pediatric acute myeloid leukemia

MARTINI, ALBERTO
2021/2022

Abstract

BACKGROUND Acute myeloid leukemia (AML) treatment remains a challenge mainly due to its genetic heterogeneity and biological complexity. In particular, refractory and relapsing forms are the main cause of mortality related to this pathology. From a pediatric perspective, AML did not achieve survival rates of lymphoblastic leukemia despite intensive chemotherapy protocols, large use of hematopoietic stem cell transplantation and supportive care improvements. Nowadays, the development of new therapies is still an unmet clinical need to improve AML survival. Numerous clinical trials and pre-clinical studies of new immunotherapy-based drugs are under development, with some of them either approved or being approved. Among the latter, six are based on CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T cells) technology, one of the forms of T-cell immunotherapy called adoptive cell transfer (ACT). CAR-T cells are engineered T cells ex vivo expressing a membrane receptor that combines the specificity of the variable component of immunoglobulins with the cytotoxic activity of T cells. Drugs currently in clinical use are specific for CD19 and BMCA antigens with indication for B cell neoplasms and multiple myeloma, respectively. AIM OF THE STUDY In this thesis, an innovative preclinical protocol has been applied for the development of second-generation CAR-T cells directed against two new antigens identified in AML blasts: CD-A and CD-D. In particular, two variable chains, G1 and H3, were tested directed against the first antigen and F12 and B8 against the second. T cells were analyzed for characteristics and immunophenotype and co-cultured with target AML cell lines to test lytic activity and specificity. In addition, the toxicity of constructs directed toward hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) has also been evaluated. MATHERIALS AND METHODS Each CAR cassette was cloned into a plasmid transfer to produce third-generation lentiviral vectors (LVs). T cells were isolated from healthy donors by gradient centrifugation of density and magnetic separation, activated and transduced with MOI of 10. Transduction efficiency was measured by ddPCR. After 14 days of expansion, T cells were cultured with SHI-1 and HL-60 target cell lines, and K562 and MOLM-13 cell lines, negative for CD-D and CD-A respectively, to assess specificity. After 48 hours of co-culture, mortality was measured by flow cytometry with Annexin V and 7-AAD, and by luciferase viability assay. Finally, toxicity was measured by colony-forming unit (CFU) count by metabolic assay with MTT. RESULTS CAR-T cells, effectively transduced and viable, had a predominantly CD4+ phenotype, with mainly central memory (Tcm), naive (Tn) and stem cell memory (Tscm) differentiation, with an expansion, on average, from 2 to 20 folds. Furthermore, the four chains did not affect the activation and exhaustion of CAR-T cells. In both assays, all chains showed lytic activity against the target cell lines. However, only the B8 and F12 constructs demonstrated specificity towards CD-D. Finally, these chains did not show toxicity HSPCs. CONCLUSIONS Results demonstrated that all ScFv chains have efficacy against AML blasts without toxicity towards stem cells. However, only CAR-T cells directed against the CD-D antigen showed a specific lysis. The main problem encountered in the use of this protocol was the expansion of CAR-T cells, which was below expectations. In conclusion, all four chains demonstrated a great potential for a novel immunotherapy approach.
Dipartimento di Medicina - DIMED
2021
Early preclinical development of a CAR-T cell approach targeting novel antigens associated to pediatric acute myeloid leukemia
INTRODUZIONE La leucemia acuta mieloide (LAM) rimane ancora oggi una sfida per quanto riguarda il trattamento. Inoltre, le forme refrattarie e recidivanti ne sono la causa principale di mortalità. Dal punto di vista pediatrico, la LAM non ha raggiunto la sopravvivenza della leucemia linfoblastica nonostante l’intensificazione della chemioterapia, l’uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche e il miglioramento della terapia di supporto. Lo sviluppo, quindi, di nuove cure è necessario per ottenere valide alternative al trattamento dei pazienti con LAM. Nuovi farmaci basati sull’immunoterapia sono in sviluppo, tra i quali sei sono basati sulla tecnologia CAR-T, una forma di immunoterapia a cellule T. Le cellule CAR-T sono linfociti T ingegnerizzati ex vivo esprimenti un recettore di membrana che combina la specificità della componente variabile delle immunoglobuline con l’attività citotossica dei linfociti T. I farmaci correntemente in uso clinico sono specifici per gli antigeni CD19 e BMCA con indicazione rispettivamente per neoplasie a cellule B e mieloma multiplo. SCOPO DELLO STUDIO In questo lavoro di tesi è stato applicato un protocollo preclinico innovativo per lo sviluppo di cellule CAR-T di seconda generazione dirette contro due nuovi antigeni identificati nei blasti di LAM: CD-A e CD-D. In particolare, sono state testate due catene variabili, G1 e H3, dirette contro il primo antigene e altre due, F12 e B8, contro il secondo. I linfociti T sono stati analizzati per caratteristiche e fenotipo e posti in coltura con linee cellulari di LAM per testare l’attività litica specifica. Inoltre, è stata anche valutata la tossicità dei costrutti nei confronti di cellule staminali ematopoietiche sane. MATERIALI E METODI Ogni cassetta con il costrutto CAR è stata clonata in un plasmide transfer per la produzione di vettori lentivirali (VL) di terza generazione. I linfociti T sono stati isolati da donatori sani tramite centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica, attivati e trasdotti con MOI di 10. L’efficienza di trasduzione è stata misurata tramite ddPCR. Dopo 14 giorni di espansione, i linfociti T sono stati caratterizzati per fenotipo, attivazione ed esaurimento e posti in coltura con le linee SHI-1 e HL-60, doppie positive per l’antigene, come target e le linee K562 e MOLM-13, rispettivamente negative per CD-D e CD-A, per valutare la specificità. Dopo 48 ore di co-cultura, la mortalità è stata misurata tramite citometria a flusso con Annessina V e 7-AAD, e tramite saggio di vitalità della luciferasi. Infine, la tossicità è stata misurata tramite la conta di unità formanti colonia (CFU) mediante saggio metabolico con MTT. RISULTATI Si è osservato che le cellule CAR-T, efficacemente trasdotte e vitali, presentano un fenotipo prevalentemente CD4+, con differenziazione prevalentemente central memory (Tcm), naive (Tn) e stem cell memory (Tscm). L'espansione, in media, va da 2 a 20 volte. Inoltre, si è dimostrato che le quattro catene non alterano l’attivazione e l’esaurimento delle cellule CAR-T. In entrambi i saggi, tutte le catene hanno evidenziato attività litica nei confronti delle linee target. Tuttavia, solo i costrutti B8 e F12 hanno presentato specificità nei confronti dell’antigene. Infine, si è osservato che tali catene non causano tossicità nei confronti di cellule staminali ematopoietiche sane. CONCLUSIONI I risultati hanno dimostrato che tutte le catene possiedono efficacia nei confronti dei blasti di LAM senza evidenziare tossicità nei confronti delle cellule staminali sane. Tuttavia, solo le cellule CAR-T dirette contro l’antigene CD-D hanno mostrato una lisi specifica. Il problema principale riscontrato nell’utilizzo di tale protocollo è stata l’espansione delle cellule CAR-T. In conclusione, si può affermare che tutti e quattro i CAR hanno dimostrato un grande potenziale per un innovativo approccio immunoterapico.
CAR-T
AML
Immunotherapy
Leukemia
CAR-T cell therapy
PIGAZZI, MARTINA
Lauree magistrali a ciclo unico
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