Identificazione dei neuroni simpatici come ulteriore tipo cellulare affetto nella Sclerosi Laterale Amiotrofica

Razionale. La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neuromuscolare caratterizzata da degenerazione dei motoneuroni (MN), paralisi ed un'aspettativa di vita di 3-5 anni dopo la diagnosi. I meccanismi patogenetici sono compresi solo parzialmente e, nonostante gli investimenti nella ricerca, non sono disponibili cure mirate. Originariamente definita come malattia del MN, numerosi studi evidenziano invece come la SLA sia una patologia multicellulare. Inoltre, una serie di evidenze supporta la presenza di un’alterazione del Sistema Nervoso Autonomo (SNA). I neuroni simpatici (NS), che rilasciano noradrenalina e Neuropeptide Y, innervano quasi tutti i tessuti, compresi i muscoli scheletrici, dove interagiscono con i miociti a livello della Giunzione Neuro-Muscolare (GNM), a livello della quale si concentrano i recettori β2-adrenergici. Scopo dello studio L’obiettivo di questo studio è definire se i NS rappresentino un ulteriore tipo cellulare affetto nella SLA. Materiali e metodi. Abbiamo combinato lo studio mediante immunofluorescenza (IF) dell’innervazione simpatica nel muscolo scheletrico di modelli sperimentali di SLA, causata dalla mutazione G93A nel gene codificante la superossido-dismutasi (SOD1G93A), con un’analisi in vitro di NS isolati. I risultati sono stati validati in biopsie muscolari, ottenute da pazienti affetti da SLA ed individui di controllo e mediante la valutazione di indici di funzionamento del SNA, quali parametri ECG standard, Heart Rate Variablity e incidenza di aritmie. Risultati. Sezioni di muscoli scheletrici da topi maschi SOD1G93A e relativi controlli, a diverse età, sono state marcate per identificare la GNM e i NS. L'acquisizione di sezioni ottiche sequenziali ha permesso di evidenziare che i processi dei NS che innervano i muscoli sono più sottili e di densità ridotta (riduzione 15.0±2.3%, p<0.01) nei topi modello di SLA rispetto ai controlli, già allo stadio iniziale della malattia e la denervazione peggiora nel tempo, raggiungendo negli stadi avanzati della malattia una riduzione del 57.2±5.6%, p<0.001. Per valutare gli effetti primari della mutazione SOD1G93A sui NS, cellule in coltura sono state infettate con adenovirus codificanti la proteina SOD1 umana normale o SOD1G93A umana. Come controllo aggiuntivo, è stato utilizzato il vettore virale non codificante Ad-Empty. È stata determinata la relazione dose-effetto del trattamento virale, analizzando la vitalità cellulare. Per la sovra-espressione di SOD1G93A, non sono stati rilevati effetti significativi sulla vitalità cellulare a concentrazioni inferiori a MOI-10 (Molteplicità di Infezione). MOI più elevate (25, 50) ha causato una massiva morte cellulare. La sovra-espressione di hSOD1wt e l’infezione con il vettore virale di controllo, anche a MOI elevate, non hanno invece influenzato la vitalità cellulare. La sovra-espressione della SOD1 è stata verificata a livello traslazionale, mediante Western Blotting. L'analisi qualitativa della morfologia cellulare e le analisi dell'intensità di fluorescenza della TH non hanno evidenziato differenze significative tra NS controllo e hSOD1wt, mentre i NS SOD1G93A hanno mostrato ridotto sprouting assonale, processi più sottili, ridotta intensità di fluorescenza della TH e varicosità distribuite irregolarmente. Simili alterazioni nella morfologia e topologia neuronale sono state osservate in biopsie muscolari di pazienti affetti da SLA. Consistentemente con questo dato, nei pazienti SLA sono state osservate un’alterazione dell’Heart Rate Variability e una maggiore incidenza di eventi aritmici, suggestivi per la presenza di una disfunzione di queste cellule. Conclusioni. I risultati di questo studio suggeriscono che i NS rappresentano un ulteriore tipo cellulare affetto nella SLA e che la mutazione SOD1G93A colpisce direttamente i NS, ponendo le basi per ulteriori studi volti a caratterizzarne gli effetti sulla biologia cellulare.