Effetto dell’inibizione delle deacetilasi istoniche sulla calcificazione valvolare aortica: risultati di uno studio in vitro.

Background: Valproic acid is an antiepileptic drug which, among its various pharmacodynamic effects, has an epigenetic action by inhibiting some classes of histone deacetylases (HDAC). There is growing in vitro evidence that VPA-induced HDAC inhibition promotes osteoblastic differentiation of different cell types and recent studies have observed an increased risk of atherosclerosis in epileptic patients treated with VPA. Aim of the study: Study the effects of VPA-mediated inhibition of histone deacetylases (HDAC) in an in vitro model of calcification. Methods: Human interstitial valve cells (hVIC) were seeded in multi-well plates and were stimulated with 5.0 mM VPA alone or with an osteogenic medium (OM) (ascorbic acid 283 µM, dexamethasone 100 nM, inorganic phosphate 2 mM) added or not with VPA. The treatments lasted for 12 days. At the end of the treatment, proteins and RNA were extracted for western blotting analysis and gene expression studies (RT-PCR). The activity of alkaline phosphatase (ALP) and calcium deposition were quantified by colorimetric analysis. Results: The VICs are treated for 12 days with 5.0 mM VPA. They showed an increase in alkaline phosphatase activity compared to the control condition. The increase becomes statistically significant (p<0.05) if the VPA is added to the osteogenic medium. Gene expression analysis revealed a significant increase in ALP, BMP-2 and IL-6 in hVICs treated with osteogenic medium and / or VPA. The calcium dosage showed that the increase in ALP activity in the OM plus VPA condition is associated with a significant increase in extracellular calcium deposition. From the analysis of the protein expression of acetylated histone H3, a significant increase was shown with osteogenic medium added with VPA. This increase is attributable to the regulatory action of VPA on HDACs. Histological analysis of human calcific aortic valve flaps revealed the presence of acetylated histone H3 in the pathological valve tissue. Conclusions: VPA-induced HDAC inhibition promotes pro-calcific differentiation in hVIC through increased gene expression of osteogenesis and inflammation markers. Further studies are needed to confirm in vivo the relevance of this phenomenon and to understand whether the pharmacological modulation of HDAC may represent a therapeutic strategy in CAVD.

Introduzione: L’acido valproico (VPA) è un farmaco antiepilettico che, tra i vari effetti farmacodinamici, ha azione epigenetica inibendo alcune classi di deacetilasi istoniche (HDAC). Vi sono crescenti evidenze in vitro che l’inibizione delle HDAC, indotta da VPA, promuova la differenziazione in senso osteoblastico di diversi tipi cellulari e studi recenti hanno osservato un aumento del rischio di aterosclerosi in pazienti epilettici trattati con VPA. Scopo dello studio: Studiare il ruolo dell’inibizione delle HDAC, mediato da VPA, sulla differenziazione pro-calcifica delle cellule interstiziali valvolari aortiche. Materiali e metodi: Cellule valvolari interstiziali umane (hVIC) seminate in piastre multi-pozzetto sono state stimolate con solo VPA 5.0 mM o con un terreno di coltura osteogenico (OM) (acido ascorbico 283 µM, desametasone 100 nM, fosfato inorganico 2 mM) addizionato o meno con VPA. I trattamenti hanno avuto una durata di 12 giorni. Al termine del trattamento, proteine e RNA sono stati estratti per l’analisi in western blotting e per lo studio dell’espressione genica (RT-PCR). L’attività della fosfatasi alcalina (ALP) e la deposizione di calcio sono state quantificate mediante analisi colorimetriche. Risultati: Le cellule trattate per 12 giorni con VPA 5.0 mM mostrano un aumento dell’ALP rispetto alla condizione controllo. L’aumento diventa statisticamente significativo (p<0.05) se il VPA viene addizionato al terreno osteogenico. L’analisi dell’espressione genica ha evidenziato un incremento significativo dell’ALP, del BMP-2 e dell’IL-6 nelle hVIC trattate con terreno osteogenico e/o VPA. I risultati del dosaggio del calcio mostrano che all’aumento dell’ALP nella condizione OM più VPA si associa un incremento significativo della deposizione di calcio extracellulare. L’analisi di espressione proteica dell’istone H3 acetilato ha evidenziato un aumento significativo dell’acetilazione nelle hVIC trattate con terreno osteogenico addizionato con VPA (tale osservazione conferma l’azione regolatoria di VPA sulle HDAC). L’analisi istologica di lembi valvolari aortici calcifici umani ha evidenziato la presenza dell’istone H3 acetilato nel tessuto valvolare patologico. Conclusioni: L’inibizione delle HDAC indotta da VPA promuove la differenziazione pro-calcifica nelle hVIC attraverso un’aumentata espressione genica di marcatori di osteogenesi e di infiammazione. Ulteriori studi sono necessari per stabilire la rilevanza in vivo di tale fenomeno e per comprendere se la modulazione farmacologica di HDAC possa rappresentare una strategia terapeutica per rallentare la progressione della valvulopatia aortica calcifica.