Sintesi e caratterizzazione chimico-biologica di nanosistemi a base peptidica ad attività antitumorale

La terapia peptidica sta largamente prendendo piede negli ultimi anni poiché, oltre ad essere economicamente vantaggiosa rispetto alle terapie con anticorpi monoclonali comunemente in uso, offre la possibilità di sviluppare una medicina personalizzata e di sfruttare il trasporto attivo e non solo passivo per raggiungere il target riducendo così il rischio di agire sui tessuti sani. Questa terapia può essere applicata per il trattamento di tumori, malattie genetiche, malattie autoimmuni o problemi infiammatori ma presenta lo svantaggio di non poter essere somministrata per bocca poiché i peptidi sono facilmente degradati dagli enzimi proteolitici. Tra i peptidi bioattivi di origine naturale troviamo i lipopeptaibolici, una classe di peptidi antimicrobici e membrano-attivi che presentano resistenza alla degradazione enzimatica, capacità di interagire in maniera specifica con le membrane plasmatiche ed una struttura elicoidale stabile di tipo misto α/310. Il capostipite dei lipopeptaibolici è la Tricogina GA IV, peptide debolmente anfifilico di 11 residui amminoacidici, prodotto dal fungo Tricoderma longibrachiatum. Il presente lavoro di tesi è nato con l’obiettivo di sfruttare la membrano-attività di peptaibolici analoghi della Tricogina GA IV e valutarne l’interazione preferenziale con le cellule tumorali rispetto alle cellule sane, per applicazioni future di drug-delivery. I peptidi analoghi sintetizzati nel presente lavoro di tesi sono due: Api8, dove il residuo dell’acido α-amminoisobutirrico (Aib) in posizione 8 nel peptide wild-type è stato sostituito da un acido 4-amminopiperidin-4-carbossilico (Api); e Leu4, dove l’Aib in posizione 4 nel wild-type è stato sostituito con una Leucina (Leu). Questi analoghi sono stati sintetizzati con una combinazione di sintesi in fase solida (SPPS) ed in soluzione, in modo da avere diverse funzionalità all'estremità C-terminale, utili a varie applicazioni: (i) l’estremità C-terminale Leucinolo (Lol) della tricogina nativa è stata sostituita con una Leucina-ammide per abbattere i costi di produzione. Il peptide con estremità ammidica è stato utilizzato per saggiarne la citotossicità. (ii) Il peptide legato alla 5/6-fluoresceina isotiocianato (FITC) è stato utilizzato per analisi di citofluorimetria. (iii) Il peptide legato all'acido lipoico è stato legato a nanoparticelle d’oro (AuNPs) prodotte per ablazione laser ed è stato utilizzato per valutare l’interazione di questi sistemi con le membrane cellulari e la loro citotossicità. I peptidi sintetizzati sono stati caratterizzati con varie strumentazioni quali HPLC a fase inversa (RP-HPLC), spettrometria di massa (MS), dicroismo circolare (CD). I sistemi nanoparticellari funzionalizzati con peptidi sono stati caratterizzati con spettrometria UV-Vis, Dynamic Light Scattering (DLS) e Transmission Electron Microscopy (TEM). Tutti i sistemi a base peptidica sono stati testati in vitro su cellule di adenocarcinoma della ghiandola mammaria (linea MDA-MB-231) e su cellule epiteliali di ghiandola mammaria (linea MCF10A) come controparte sana. La citotossicità dei peptidi e delle nanoparticelle funzionalizzate con i peptidi è stata valutata con il saggio MTS, mentre la loro internalizzazione con la citofluorimetria. Le nanoparticelle d’oro risultano inerti all’interno dell’organismo e, se utilizzate per trasportare un farmaco, possono ridurne la clearance e rilasciarlo in maniera controllata in seguito ad un determinato stimolo. I sistemi a base peptidica individuati in questo lavoro di tesi, presentano un'interazione preferenziale verso le cellule tumorali e introducono un obiettivo a lungo termine: fornire nuovi strumenti terapeutici alternativi ai trattamenti antitumorali classici.