TERT, la componente catalitica della telomerasi, promuove la progressione del ciclo cellulare via MYC: evidenza delle funzioni extra telomeriche della telomerasi

Maintenance of telomere length, required for the unlimited cell proliferation displayed by cancer cells, is provided by telomerase, a ribonucleoprotein complex containing a specialized reverse transcriptase, TERT (telomerase reverse transcriptase), that uses an internal RNA template to maintain telomeres length, thus playing a critical role in tumor formation and progression. TERT is usually repressed in normal somatic cells but is detectable in the vast majority of tumors. Recent studies have suggested that besides maintaining telomeres, TERT is involved in other cellular functions, and it may contribute to carcinogenesis also via telomere length-independent mechanisms; therefore, its inhibition could represent a promising strategy to improve cancer treatment, regardless of telomere length and erosion. On this ground, results obtained in our laboratory demonstrated that short-term TERT inhibition by BIBR1532 (BIBR), an inhibitor of TERT catalytic activity, induced significant cell cycle arrest with an accumulation of cells in the S-phase in in vitro models of B-cell lymphoproliferative disorders, i.e Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized lymphoblastoid cell lines (LCLs), and B-cell malignancies, i.e Burkitt’s lymphoma (BL) cell lines, and in vivo, in zebrafish model, without affecting telomere-length. This study aimed to characterize the molecular mechanism(s) through which TERT inhibition impairs cell cycle progression in in vitro models of post-transplant lymphoproliferative disorders (LCL) and B-cell malignancies (BL). TERT-positive cell lines (LCL and BL) were treated with BIBR or DMSO, as control, for 24 hours. The expression of genes involved in the cell cycle regulation, such as MYC and p21, was evaluated both at mRNA level, through real-time PCR, and protein level, through immunofluorescence (IF) and/or western blot. Results demonstrated that cell cycle arrest in S-phase induced by TERT inhibition was associated with a significative decrease of MYC expression both at transcriptional and protein levels (30 μM decreased MYC protein expression compared to control of 42±2%, p<0,01, in LCL cells, and 44±3%, p<0,01, in BL cells). Of interest, this inhibition was associated with a decreased NF-κB p65 nuclear level (evaluated through western blot), leading to the down-regulation of a subset of NF-κB target genes, including MYC. Moreover, the MYC down-regulation induced by TERT inhibition was associated with increased p21 expression compared to controls at mRNA and protein levels. In particular, IF analysis highlighted an increase in the p21 signal compared to the control of 3,12±0,53 times, p<0.01, in LCL cells, of 2,25±0,37 times, p<0,01, in BL cells. Finally, western blot and IF analysis revealed that in BIBR-treated cells, p21 protein levels increased in the nuclear compartment compared to controls. In conclusion, our results suggest that cell cycle arrest induced by TERT inhibition is associated with the decrease of MYC levels mediated by the down-regulation of the NF-κB pathway. The consequent alteration of the MYC transcriptional program is associated with an increment of p21 expression and nuclear localization. Since p21 is an inhibitor of cell cycle progression, these results contribute to explaining the antiproliferative effect induced by TERT inhibition, regardless of telomere length.

Il mantenimento dei telomeri, necessario per la proliferazione illimitata delle cellule tumorali, è esercitato dalla telomerasi, un complesso ribonucleoproteico contenente una trascrittasi inversa specializzata, TERT (telomerase reverse transcriptase), che utilizza un templato ad RNA per sintetizzare nuove sequenze telomeriche svolgendo quindi un ruolo critico nella formazione e nella progressione dei tumori. L’espressione di TERT è infatti solitamente repressa nelle normali cellule somatiche, mentre è rilevabile nella maggior parte dei tumori. Un numero crescente di studi ha dimostrato che TERT può contribuire alla cancerogenesi anche attraverso meccanismi indipendenti dal mantenimento dei telomeri, suggerendo quindi che la sua inibizione potrebbe rappresentare una strategia terapeutica, al di là dell’effetto sulla lunghezza dei telomeri. A questo riguardo, recenti risultati ottenuti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che l’inibizione a breve termine di TERT mediante BIBR1532 (BIBR, un inibitore selettivo di TERT), benché senza effetti sulla lunghezza dei telomeri, è in grado di indurre importanti effetti antiproliferativi con arresto del ciclo cellulare e accumulo delle cellule in fase S sia in vitro, in linee cellulari linfoblastoidi (LCL) immortalizzate dal virus di Epstein-Barr (EBV) e in linee cellulari derivate da linfoma di Burkitt (BL), che in vivo, nel modello zebrafish. Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare i meccanismi molecolari attraverso cui l'inibizione di TERT altera la progressione del ciclo cellulare nei modelli in vitro di disordini linfoproliferativi post-trapianto (linee LCL) e di tumori delle cellule B (linee BL). Le linee cellulari TERT positive (LCL e BL) sono state trattate con BIBR o DMSO, come controllo, per 24 ore. L’analisi dell’espressione di proteine coinvolte nella progressione e arresto del ciclo cellulare, quali MYC e p21, è stata condotta sia a livello di mRNA, mediante real-time PCR, che a livello proteico, mediante immunofluorescenza (IF) e/o western blot. I risultati hanno dimostrato che l'arresto del ciclo cellulare nella fase S mediato dall’inibizione di TERT era associato alla riduzione significativa dell’espressione di MYC sia a livello trascrizionale che proteico (30 μM di BIBR riduceva l’espressione proteica di MYC rispetto al controllo del 42±2%, p<0,01, nelle cellule LCL, e del 44±3%, p<0,01, nelle cellule BL). Di interesse, tale inibizione era associata a ridotti livelli nucleari di NF-κB p65 (come evidenziato mediante western blot) con conseguente riduzione dell’espressione di un sottoinsieme di geni bersaglio della via del segnale di NF-κB, incluso MYC. La ridotta espressione di MYC indotta dall'inibizione di TERT era associata ad una maggiore espressione di p21, sia a livello di mRNA che di proteina, rispetto ai controlli. In particolare, l’analisi in IF ha evidenziato un incremento del segnale di p21 rispetto al controllo di 3,12±0,53 volte, p<0.01, nelle cellule LCL, e di 2,25±0,37 volte, p<0,01, nelle cellule BL. Inoltre, le analisi in western blot e in IF hanno mostrato che, nelle cellule trattate con BIBR, i livelli proteici di p21 sono aumentati nel comparto nucleare rispetto ai controlli. In conclusione i risultati indicano che l’arresto della proliferazione cellulare indotta dall'inibizione di TERT è associato alla riduzione dei livelli di MYC mediata dall’inibizione della via di segnale NF-κB. La conseguente alterazione del programma trascrizionale di MYC è associata ad un incremento dell’espressione di p21 e della sua localizzazione nucleare. Poiché p21 esercita la sua funzione inibitoria sulla progressione del ciclo cellulare, questi risultati contribuiscono a spiegare l’effetto antiproliferativo indotto dall’inibizione di TERT, indipendente dall’accorciamento dei telomeri.