Effetto del silenziamento di SoxB1 nell’ascidia coloniale Botryllus schlosseri

L’ obiettivo della mia tesi è stato mettere a punto il metodo di silenziamento del trascritto del gene SoxB1 nel ciclo blastogenetico dell’ascidia coloniale Botryllus schlosseri. A questo scopo, si sono utilizzati degli RNA interference (iRNA) specifici per SoxB1 di B. schlosseri, e come controllo degli RNA interference per il gene LacZ di Escherichia coli. Prima di procedere con gli esperimenti di silenziamento, è stato valutato attraverso Real-Time PCR lo stadio del ciclo blastogenetico in cui il trascritto d’interesse fosse maggiormente espresso. Dai dati ottenuti si evince che SoxB1 è maggiormente espresso in uno stadio intermedio del ciclo. Per valutare l’efficacia delle molecole di iRNA, sono state eseguite anche diverse prove che sono servite a valutare dopo quante ore si ottenesse il massimo effetto di silenziamento. A tale scopo, dopo aver iniettato nel nostro organismo gli iRNA, l’mRNA è stato estratto dai diversi campioni dopo 12, 24 e 48 ore dall’iniezione. L’mRNA è stato retrotrascritto in cDNA e analizzato tramite PCR, eseguita con primer specifici per SoxB1; come gene housekeeping sono stati utilizzati dei primer per l’Elongation Factor di B. schlosseri. Dai risultati ottenuti dalla PCR si evince che il massimo del silenziamento del nostro trascritto si ha nell’intervallo tra le 12 e le 24 ore dopo l’iniezione. Per i successivi esperimenti gli iRNA sono stati quindi iniettati nelle colonie ogni 12 ore. Le colonie sono state monitorate e fotografate giornalmente allo stereomicroscopio valutando alcuni parametri quali battito del cuore, reattività agli stimoli e sviluppo degli organismi. Dopo 4 giorni di iniezioni gli animali sono stati inclusi in paraffina e sezionati per le analisi istologiche, per valutare a livello di organi e tessuti gli eventuali danni o modificazioni. Seppur preliminari, i risultati mostrano che il ciclo blastogenetico risente del silenziamento di SoxB1. Ulteriori esperimenti saranno necessari per valutare gli effetti delle iniezioni con iRNA.