Genotipizzazione e fenotipizzazione di linee zebrafish mutate in polg e polg2

Maintenance and replication of the mitochondrial genome (mtDNA) are essential for mitochondrial function and energy production in eukaryotes through the electron transport chain. Mitochondrial DNA is replicated by a set of proteins: Pol-γ, Twinkle, and the single-stranded DNA binding protein (SSBP1). Unrepaired mtDNA damage can accumulate and lead to dysfunctional mitochondria; in fact, there are fewer pathways for mtDNA repair than for nuclear DNA. Missense mutations in nuclear genes encoding for the mitochondrial DNA replisome machinery (POLG, POLG2, TWNK and SSBP1) cause changes to the biochemical functions of proteins. These mutations can damage the mtDNA and cause a set of diseases affecting different tissues in humans. The mitochondrial DNA polymerase γ is an enzyme involved in the replication and maintenance of mitochondrial DNA. The human holoenzyme consists of a catalytic subunit (POLG) and two accessory subunits (POLG2) that act as processivity factors. In humans, mutations of these genes (POLG, POLG2, TWNK and SSBP1) lead to a subset of mitochondrial diseases known as POLG-related disorders, which often cause premature death of affected patients at a young age. Zebrafish (Danio rerio) is emerging as a suitable model in genetic disease research to study POLG-related disorders. Recently, many researchers are choosing zebrafish as a genetically manipulable animal model for studying mitochondrial diseases, as the biology of this fish allows the study of a disorder of interest during different stages of development, and the optical clarity of the embryos and larvae allows real-time imaging of affected tissues during the disease. Unlike other vertebrate models, the cheap mutagenesis strategies and large-scale screening allowed the generation in zebrafish of models for a wide variety of human diseases, highlighting the potential of D. rerio to model human disorders and discover and develop new drugs. In Prof. Tiso’s laboratory, zebrafish polg and polg2 mutant models were generated using CRISPR-Cas9 genome editing, carrying a deletion in regions coding for Polg and Polg2 catalytic domains. Both mutations were lethal in homozygosity during the larval stage, demonstrating the essential role of each gene, but hindering the maintenance of stable homozygous mutant lines. By crossing adult polg+/- or polg2+/- heterozygotes, we obtained an offspring of individuals with different genotypes. It was therefore essential to carry out the genotyping of zebrafish larvae through the initial isolation of DNA from small biopsies of tails using the HotShot method, the subsequent polymerase chain reaction (PCR) to amplify the DNA region of interest, and, finally, the agarose gel electrophoresis to separate DNA fragments based on their molecular weight. After identifying the larvae genotypes, we analyzed the phenotypic differences between polg and polg2 mutants and wild type individuals in terms of survival rate, body length and size, mtDNA content and protein expression (qPCR).

Il mantenimento e la replicazione del genoma mitocondriale (mtDNA) sono essenziali per la funzione dei mitocondri e la produzione di energia negli eucarioti attraverso la catena di trasporto degli elettroni. Il DNA mitocondriale è replicato da un insieme di proteine: Pol-γ, Twinkle e la proteina legante il DNA a singolo filamento (SSBP1). Danni non riparati al mtDNA possono accumularsi e portare a mitocondri disfunzionali; infatti, esistono meno vie per la riparazione del mtDNA rispetto a quelle per il DNA nucleare. Le mutazioni missenso nei geni nucleari che codificano il replisoma del DNA mitocondriale (POLG, POLG2, TWNK e SSBP1) causano cambiamenti alle funzioni biochimiche delle proteine. Queste mutazioni possono quindi danneggiare il mtDNA e causare una serie diversificata di malattie che possono colpire diversi tessuti. La DNA polimerasi γ mitocondriale è un enzima coinvolto nella replicazione e nel mantenimento del DNA mitocondriale. L'oloenzima umano è composto da una subunità catalitica (POLG) e da due subunità accessorie (POLG2) che agiscono come fattori di processività. Nell’uomo, la mutazione dei geni in questione (POLG, POLG2, TWNK e SSBP1) porta ad un sottoinsieme di disordini mitocondriali conosciuti come POLG-related disorders, i quali causano spesso la morte prematura dei pazienti affetti in giovane età. Zebrafish (Danio rerio) sta emergendo come modello adatto nella ricerca genetica per studiare i POLG-related disorders. Infatti, negli ultimi anni, molti ricercatori interessati ad un modello animale embriologicamente e geneticamente trattabile si stanno rivolgendo allo zebrafish, in quanto la biologia di questo pesce consente lo studio del disordine di interesse in diversi stadi di sviluppo, e la traslucenza ottica degli embrioni e delle larve consente l'acquisizione di immagini (imaging) in tempo reale dei tessuti colpiti dalla patologia durante lo sviluppo. Sofisticate strategie di mutagenesi e saggio (screening) su larga scala, con un'economia che non è possibile in altri vertebrati, hanno generato modelli di zebrafish di un'ampia varietà di malattie umane, evidenziandone le potenzialità per la modellizzazione delle patologie umane e per la scoperta e lo sviluppo di farmaci. Nel laboratorio della Prof. Tiso sono stati generati modelli mutanti di zebrafish per polg e polg2 mediante l’utilizzo del sistema CRISPR-Cas9, inserendo una delezione in regioni che codificano i domini catalitici di Polg e Polg2. Entrambe le mutazioni si sono rivelate letali in omozigosi durante lo stadio larvale, dimostrando la necessità dei due geni ma rendendo impossibile il mantenimento di linee stabili omozigoti adulte. Incrociando adulti zebrafish eterozigoti per la mutazione in polg o polg2, abbiamo ottenuto una prole con genotipi differenti. È stato quindi indispensabile effettuare una genotipizzazione delle larve di zebrafish attraverso un iniziale isolamento del DNA ricavato da piccole biopsie delle code seguendo il metodo HotShot, una successiva reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare la regione del DNA di interesse, ed infine l'elettroforesi su gel d'agarosio per separare i frammenti di DNA in base al loro peso molecolare. Dopo aver identificato i genotipi delle larve, sono state analizzate le differenze fenotipiche tra i mutanti polg e polg2 e gli individui selvatici (wild type) in termini di sopravvivenza, lunghezza e dimensioni del corpo, quantità di mtDNA ed espressione proteica (qPCR).