Functional and computational analysis of human plasma membrane Ca2+ ATPase ATP2B2 mutants linked to cerebellar ataxia.

Calcium is a very important bivalent ion present in all life forms, including humans. Changes in its intracellular concentration control many cellular processes and events such as muscle contraction, regulation of gene expression, metabolism, proliferation and programmed cell death. Different transport proteins including pumps, antiports and uniports are responsible for regulating the calcium fluxes between the intracellular environment and organelles and the extracellular environment. These transporters include the plasma membrane Ca2+-ATPases (PMCA) and the plasma membrane sodium/calcium exchanger (NCX), which are responsible for the extrusion of calcium from the cytosol to the extracellular environment, and the sarco/endoplasmic Ca2+ ATPases (SERCA) which pump calcium from the cytosol to the lumen of the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum. An additional Ca2+ pump which couples the transport of Ca2+ to that of Mn2+ is present on the membrane of the Golgi apparatus and is responsible for Ca2+ accumulation in the Golgi lumen. PMCAs have a high Ca2+ affinity but low transport capacity for it. Thus, traditionally, the PMCA pump has been attributed a housekeeping role in maintaining cytosolic Ca2+ and the NCX the dynamic role of counteracting large cytosolic Ca2+ variations (especially in excitable cells). However, the existence of different PMCA isoforms and the finding of specific defect occurring according to the PMCA variant mutated suggest a more complex role for PMCA in the control of Ca2+ handling. In this work, three novel mutations in the ATP2B2 gene encoding isoform 2 of PMCA, i.e., E1010K, F878S, M837I ,identified in patients with neuromotor disabilities were studied from a functional point of view. In particular, a photon emission-based assay exploiting aequorin as a Ca2+-sensitive probe was used to monitor Ca2+ handling in living cells expressing mutant PMCA2 and models based on the 3D structure of SERCA and AlphaFold were used to characterize them from a computational point of view. Overall, the data show that among the 3 mutations, the F878S substitution strongly affected the Ca2+ extrusion ability of the PMCA2 pump.

Il calcio è un importantissimo ione bivalente presente in tutte le forme di vita, incluso l’uomo, e controlla moltissimi processi cellulari come la contrazione muscolare, la regolazione dell’espressione genica, il metabolismo, la proliferazione e la morte cellulare programmata. Diversi sistemi di trasporto presenti sulle membrane cellulari come pompe, antiporti e uniporti sono responsabili della regolazione della concentrazione di calcio tra l’ambiente intracellulare, gli organelli e l’ambiente extracellulare. Tra di essi troviamo le pompe Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica (PMCA), responsabili dell’estrusione di calcio dal citosol all’ambiente extracellulare. Le PMCA svolgono un ruolo minoritario rispetto alle SERCA o NCX nel regolare la concentrazione di calcio all’interno della cellula. Tuttavia, la loro attività è ugualmente significativa nei tessuti dove sono maggiormente espresse, come il sistema nervoso centrale. In questo lavoro, tre nuove mutazioni, E1010K, F878S, M837I, identificate nell’isoforma 2 della PMCA codificata dal gene ATP2B2 in pazienti con varie disabilità di tipo neuromotorio, sono state studiate dal punto di vista funzionale, utilizzando un saggio basato sull’emissione di fotoni che sfrutta l’equorina come sonda Ca2+-sensibile, e caratterizzate dal punto di vista computazionale, tramite la creazione di modelli realizzati in base alla struttura 3D di SERCA e AlphaFold. Complessivamente, i dati mostrano che tra le 3 mutazioni la sostituzione amminoacidica F878S abolisce la capacità della pompa di estrudere Ca2+.