Espressione e localizzazione del DNAJC13, una proteina coinvolta nella malattia di Parkinson

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterised by by the loss of neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) causing striatal dopamine deficiency. The causes and mechanisms underlying this disease are not well known but it has been shown that mutations in the DNAJC13 protein lead to altered vesicular trafficking, contributing to the manifestation of MP. The aim of this study was to characterise the expression of DNAJC13 by means of western blot and immunocytochemistry techniques. Specifically, the following was used a plasmid shared by Japanese researcher Kiyotoshi Sekiguchi to express the DNAJC13 protein bound to a GFP tag. After amplifying it using the MIDI protocol, we checked its integrity by comparing the results of digestion with HindIII in silico with those experimental ones; its expression was then observed in HEK293T cells. Subsequently, the cells were lysed and the DNAJC13-GFP was purified to verify the molecular weight of the protein by western blot. Finally, treatment was performed with epidermal growth factor (EGF) because it appears from the literature that DNAJC13 is involved in its endocytosis. The cells were subjected to the immunocytochemistry protocol and then analysed under a fluorescence microscope to trace any differences in localisation of the protein following treatment with EGF.

La malattia di Parkinson (MP) è un disturbo neurodegenerativo contraddistinto dalla perdita di neuroni nella substantia nigra pars compacta (SNpc) che causa carenza di dopamina striatale. Le cause e i meccanismi alla base di questa malattia non sono ben noti ma si è visto che mutazioni a carico della proteina DNAJC13 comportano un alterato traffico vescicolare contribuendo alla manifestazione della MP. Lo scopo di questo studio è stato caratterizzare l’espressione di DNAJC13 tramite tecniche di western blot e di immunocitochimica. Nello specifico è stato utilizzato un plasmide condiviso dal ricercatore giapponese Kiyotoshi Sekiguchi per esprimere la proteina DNAJC13 legata ad un tag GFP. Dopo averlo amplificato con il protocollo MIDI, abbiamo controllato la sua integrità confrontando i risultati della digestione con HindIII in silico con quelli sperimentali; è stata poi osservata la sua espressione nelle cellule HEK293T. Successivamente le cellule sono state lisate e il DNAJC13-GFP è stato purificato per verificare il peso molecolare della proteina attraverso un western blot. Infine, è stato eseguito un trattamento con il fattore di crescita dell’epidermide (EGF) perché da letteratura sembra che il DNAJC13 sia coinvolto nella sua endocitosi. Le cellule sono state sottoposte al protocollo di immunocitochimica e poi analizzate al microscopio a fluorescenza per risalire ad eventuali differenze di localizzazione della proteina in seguito al trattamento con l’EGF.