Il G protein-coupled estrogen receptor (GPER) agisce come recettore per l'aldosterone? Studio di interazione tra aldosterone e GPER.

Steroid-hormone action in the classical view is mediated by intracellular receptors: the hormone–receptor complex binds to DNA to activate or repress transcription of target genes. However, all classes of steroid hormones can additionally act through non-genomic mechanisms and thereby change physiological processes. In contrast to genomic steroid actions, these non-genomic effects are characterized with rapid onset. G protein-coupled oestrogen receptor (GPER) was identified and recognised as a membrane receptor that mediates the rapid effects of 17b-estradiol. GPER belongs to the large family of 7-transmembrane domain G protein-coupled receptors and has been reported to couple with both Gs and Gi/o proteins. Non-genomic effects of aldosterone on various target organs and cells have been described, i.e., vascular smooth muscle cells and endothelial cells, skeletal muscle cells, kidney cells and zona glomerulosa cells. Recently, it was reported that these rapid non-genomic effects of aldosterone are mediated by its interaction with GPER. However, it is unclear if this effect is through an interaction between the aldosterone signalling, involving mineralocorticoid receptor, and GPER or if aldosterone can directly activate GPER. Aim. We investigated if aldosterone directly interacts with GPER. Materials and methods. We performed a Docking Analysis to predict the binding site between aldosterone and GPER. Surface Plasmon Resonance (SPR) experiments were performed on a BIAcore-X100 instrument to monitor the interaction between aldosterone and GPER. GPER, commercially available, was covalently immobilized on a CM5 sensor chip using an amine-coupling chemistry. Ten concentrations of aldosterone were injected on sensor GPER-chip and the dissociation constant (Kd) was obtained. 17 β-estradiol was used as positive control for the experiments as it is a well know ligand for GPER. To obtain overexpression of GPER protein with post-transcriptional modification (i.e. glycosylation) to be used in functional tests, HEK293 cells were transfected with GPER plasmid. GPER transfection was obtained with electroporation using Nucleofection® Technology. GPER expression after transfection was investigated with qRT-PCR and Western Blot. Immunoprecipitation with a specific antibody against GPER was performed to isolate specifically GPER. Results. Docking analysis showed that aldosterone can interact with GPER, and this interaction involves a transmembrane portion of the receptor. The specific amino acid sequences identified were 137-FFLTWMSF-144 and 168-SCGLIWMAS-176.The aldosterone-GPER binding site identified with docking analysis was like that for 17 b-estradiol were 133-YSSVFFLTWMS-143 and 167-LSCGLIWM-174. SPR confirmed the interaction aldosterone-GPER with a Kd = 0,902 ± 0,230 µM. Comparable affinity between 17 β-estradiol and GPER was obtained (Kd = 0,818 ± 0,273 µM). After GPER-transfection, high levels of GPER gene were found in HEK293 (+ 600-fold vs non-transfected cells). Finally, we obtained the purification and isolation of GPER by immunoprecipitation, this was confirmed by the presence of only one specific band at expected molecular weight in immunoblot analysis. Conclusions. These data are of enormous interest as they for the first time showed that aldosterone can directly interact with GPER. Despite this, other tests are necessary with glycosylated-GPER obtained by transfection of HEK293 cells, to finally prove this interaction.

L'azione steroideo-ormonale nella visione classica è mediata dai recettori intracellulari: il complesso ormone-recettore si lega al DNA per attivare o reprimere la trascrizione dei geni bersaglio. Tuttavia, tutte le classi di ormoni steroidei possono inoltre agire attraverso meccanismi non genomici e quindi modificare i processi fisiologici. In contrasto con le azioni degli steroidi genomici, questi effetti non genomici sono caratterizzati da una rapida insorgenza. Il recettore degli estrogeni accoppiato alla proteina G (GPER) è stato identificato e riconosciuto come un recettore di membrana che media i rapidi effetti del 17b-estradiolo. GPER appartiene alla grande famiglia dei recettori accoppiati alla proteina G del dominio 7-transmembrana ed è stato segnalato per accoppiarsi con proteine Gs e Gi/o. Sono stati descritti effetti non genomici dell'aldosterone su vari organi e cellule bersaglio, cioè cellule muscolari lisce vascolari e cellule endoteliali, cellule muscolari scheletriche, cellule renali e cellule della zona glomerulosa. Recentemente, è stato riferito che questi rapidi effetti non genomici dell'aldosterone sono mediati dalla sua interazione con GPER. Tuttavia, non è chiaro se questo effetto sia attraverso un'interazione tra la segnalazione dell'aldosterone, che coinvolge il recettore mineralcorticoide, e GPER o se l'aldosterone può attivare direttamente GPER. Obiettivo. Abbiamo studiato se l'aldosterone interagisce direttamente con GPER. Materiali e metodi. Abbiamo eseguito una Docking Analysis per prevedere il sito di legame tra aldosterone e GPER. Esperimenti di Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR) sono stati eseguiti su uno strumento BIAcore-X100 per monitorare l'interazione tra aldosterone e GPER. GPER, disponibile in commercio, è stato immobilizzato covalentemente su un chip sensore CM5 utilizzando una chimica di accoppiamento amminico. Dieci concentrazioni di aldosterone sono state iniettate sul sensore GPER-chip ed è stata ottenuta la costante di dissociazione (Kd). 17 β-estradiolo è stato utilizzato come controllo positivo per gli esperimenti in quanto è un ligando ben noto per GPER. Per ottenere la sovraespressione della proteina GPER con modificazione post-trascrizionale (cioè glicosilazione) da utilizzare nei test funzionali, le cellule HEK293 sono state trasfettate con plasmide GPER. La trasfezione GPER è stata ottenuta con elettroporazione utilizzando la tecnologia Nucleofection®. L'espressione di GPER dopo la trasfezione è stata studiata con qRT-PCR e Western Blot. L'immunoprecipitazione con un anticorpo specifico contro GPER è stata eseguita per isolare specificamente GPER. Risultati. L'analisi di attracco ha mostrato che l'aldosterone può interagire con GPER e questa interazione coinvolge una porzione transmembrana del recettore. Le sequenze apminoacidiche specifiche identificate sono state 137-FFLTWMSF-144 e 168-SCGLIWMAS-176. Il sito di legame aldosterone-GPER identificato con l'analisi di attracco era simile a quello per 17 b-estradiolo erano 133-YSSVFFLTWMS-143 e 167-LSCGLIWM-174. SPR ha confermato l'interazione aldosterone-GPER con un Kd = 0,902 ± 0,230 μM. È stata ottenuta un'affinità comparabile tra 17 β-estradiolo e GPER (Kd = 0,818 ± 0,273 μM). Dopo la trasfezione GPER, sono stati trovati alti livelli di gene GPER in HEK293 (+ 600 volte rispetto alle cellule non trasfettate). Infine, abbiamo ottenuto la purificazione e l'isolamento di GPER mediante immunoprecipitazione, ciò è stato confermato dalla presenza di una sola banda specifica a peso molecolare atteso nell'analisi immunoblot. Conclusioni. Questi dati sono di enorme interesse in quanto per la prima volta hanno dimostrato che l'aldosterone può interagire direttamente con GPER. Nonostante ciò, sono necessari altri test con GPER glicosilato ottenuto per trasfezione di cellule HEK293, per dimostrare finalmente questa interazione.