Misure dell'affollamento molecolare nelle cellule viventi

The intracellular environment is formed by a variegated and heterogeneous mixture of solutes, including free ions and larger molecules. These are characterised by relatively low diffusion coefficients and, in some extreme cases, get bound because of the interaction with large complexes of the cell like the cytoskeleton or other organelle structures. It is known that molecular crowding within the cell changes depending on local protein synthesis and degradation and that these changes induce ion fluxes (typically K+, Na+ and Cl-) compensating for variation in osmolarity. Ions, in turn, play a role in the control of neuronal membrane potential and – therefore – in brain excitability. Recent data suggest that in cortical neurons there is a strong daily fluctuation in Cl- concentration. Given the connection between molecular crowding and ion fluxes, it is expected that molecular crowding can have an impact on these Cl- fluctuations and, eventually, on the brain excitability itself. Following this hypothesis, the aim of this project is to design and validate a method based on Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) and Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) to measure molecular crowding in vitro and to evaluate its extension to in vivo studies.

L'ambiente intracellulare è formato da un miscuglio variegato ed eterogeneo di soluti, inclusi ioni liberi e molecole più grandi. Queste sono caratterizzate da coefficienti di diffusione relativamente bassi e, in alcuni casi estremi, si legano a causa dell'interazione con grandi complessi cellulari come il citoscheletro o altre strutture di organelli. È noto che il crowding molecolare all'interno della cellula cambia a seconda della sintesi e della degradazione proteica locale e che questi cambiamenti inducono flussi ionici (tipicamente K+, Na+ e Cl-) compensando la variazione dell'osmolarità. Gli ioni, a loro volta, svolgono un ruolo nel controllo del potenziale di membrana neuronale e, quindi, nell'eccitabilità cerebrale. Dati recenti suggeriscono che nei neuroni corticali c'è una forte fluttuazione giornaliera della concentrazione di Cl-. Data la connessione tra crowding molecolare e flussi ionici, ci si aspetta che il crowding molecolare possa avere un impatto su queste fluttuazioni di Cl- e, infine, sull'eccitabilità cerebrale stessa. Seguendo questa ipotesi, lo scopo di questo progetto è quello di progettare e validare un metodo basato sulla Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) e sulla Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) per misurare il crowding molecolare in vitro e valutarne l'estensione agli studi in vivo.