Distrofia Muscolare: Espressione, purificazione e caratterizzazione della regione extracellulare del delta Sarcoglicano

Il delta-sarcoglicano (dSG) è una proteina di membrana facente parte di un complesso quaternario presente al livello, in primo luogo, del sarcolemma. Il complesso interagisce con la distrofina e le altre glicoproteine associate, facenti parte del complesso DAPC (Dystrophin-Associated Protein Complex). Mutazioni geniche sul sistema dei SG, comportano un ripiegamento errato delle proteine o un’errata interazione tra le diverse facenti parti del complesso, portando a una carenza di attività o alla carenza del complesso tetramerico totale sulla membrana, aumentando così la fragilità della stessa. Questo porta allo sviluppo della distrofia muscolare (DM) nell’individuo, in particolare le LGMD2, distrofie muscolari del cingolo pelvico, altrimenti note come Sarcoglicanopatie (SGP). Le funzioni del complesso non sono ancora del tutto conosciute; se è dimostrato il ruolo fondamentale nella regolazione della stabilità della membrana muscolare durante i fenomeni di contrazione e rilassamento muscolare, è invece solo ipotizzata la funzione nella segnalazione intra-extra cellulare mediata dal tetramero. Negli ultimi anni, lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante ha permesso la produzione di elevate quantità di proteine umane in cellule ospite non umane consentendo di ottenere un prodotto puro e privo di contaminazioni virali. I sistemi di espressione attualmente disponibili per la produzione di proteine di interesse terapeutico sono molteplici e la scelta del sistema dipende dalla natura del prodotto proteico desiderato. Il batterio E. Coli è il sistema di prima scelta per l’espressione di molte proteine in quanto ne consente la produzione in grandi quantità in modo semplice e poco costoso. L’obiettivo di questo elaborato di tesi è esprimere la porzione extracellulare di dSG umano in cellule di E. Coli. La sequenza di DNA codificante per il dSG WT è stato ingegnerizzato con una coda di poli-istidine all’estremità N-terminale, per facilitare il processo di purificazione. La proteina è stata purificata mediante IMAC (Cromatografia di Affinità su ioni Metallici Immobilizzati) con colonna funzionalizzata con rame. Il dSG è stato quindi purificato con resa del 98% e con un grado di purezza pari al 95%. La proteina è stata quindi caratterizzata chimicamente mediante spettrometria di massa ad elevata risoluzione e conformazionalmente usando diverse spettroscopiche (Dynamic Light Scattering, Dicroismo Circolare, spettroscopia di emissione di fluorescenza), convalidando lavori computazionali precedenti che attribuivano la presenza di domini strutturati a β-foglietto e ponti disolfuro intra ed extra molecolari. Infine, nota la similarità di sequenza con EGF (Epitelial Grow Factor) è stata determinata l’affinità di interazione con il recettore EGFR, mediante Surface Plasmon Resonance (SPR). EGFR è stato covalentemente immobilizzato su un opportuno sensor chip sfruttando la chimica di coupling delle ammine e l’affinità di interazione del dSG WT è stata determinata. I risultati di questo lavoro di Tesi suggeriscono come l’espressione in E. Coli di dSG sia un metodo economico e ad alta resa per esprimere proteine ricombinanti di interesse terapeutico. La proteina così espressa sarà usata per lavori futuri come modello per lo studio di ligandi fisiologici, non ancora identificati, e come modello di target terapeutico per la scoperta di possibili farmaci.