Neuro-Coagulopatie: Effetto di alpha-sinucleina e delle sue mutazioni patologiche sulla generazione di Fibrina

L'α-sinucleina (α-syn) è una piccola proteina presinaptica di 140 amminoacidi, intrinsecamente non ripiegata. L’ α-syn è altamente conservata tra i vertebrati, gioca un ruolo fondamentale nella comparsa e nella progressione di alcune malattie neurodegenerative, definite α-sinucleopatie. Diversi aggregati amiloidogenici di α-sin, infatti, si sono trovati a livello cerebrale di pazienti affetti da α-sinucleopatie. Strutturalmente l’α-syn si compone di tre regioni: una regione N-terminale carica positivamente, una porzione centrale idrofobica definita NAC e una coda C-terminale negativa altamente destrutturata. Nel dominio N-terminale della proteina sono state identificate 4 mutazioni puntiformi (A53T, H50Q, A30P, E46K), responsabili dell’insorgenza del morbo di Parkinson ad esordio precoce, che incidono sulla costante cinetica di fibrillazione della proteina. Le mutazioni A53T ed E46K aumentano complessivamente la capacità di aggregazione di α-syn: A53T velocizza la formazione di fibrille, mentre E46K favorisce la presenza di una struttura monomerica più incline ad oligomerizzare. A30P è responsabile dell’attenuazione dell’α-syn a formare α-eliche, mentre favorisce l’equilibrio verso una struttura a β-foglietto. La mutazione H50Q accelera invece l’aggregazione di α-syn in vitro. In condizioni fisiologiche l’α-syn si presenta in forma monomerica solubile destrutturata, tende a strutturarsi in α -elica in presenza di membrane, mentre una forma tetramerica è stata recentemente identificata nei globuli rossi. La proteina è presente anche a livello del cuore, muscolo scheletrico, reni, fegato ed è stata identificata anche nel sangue, soprattutto a livello delle cellule ematopoietiche. Più del 99% dell’α-syn è situata negli eritrociti, mentre il restante è suddiviso tra plasma (0.1%), piastrine (0.2%) e cellule mononucleate (0.05%). Da precedenti studi eseguiti nel nostro Laboratorio, è stato dimostrato che α-syn presenta blande proprietà di antiaggregante piastrinico, agendo come regolatore negativo dell'attivazione piastrinica, interferendo con l’attivazione dei recettori transmembrana PARs, promossa da trombina. È stato dimostrato che in seguito ad attivazione delle piastrine, si ha il rilascio del contenuto degli α-granuli nel flusso ematico, con aumento notevole delle concentrazioni locali di α-sinucleina. L’obiettivo di questo progetto di tesi è stato quello di verificare se l’α-syn presente nel flusso sanguigno sia in grado di interagire con il fibrinogeno, proteina plasmatica più abbondantemente presente nel sangue. In particolare, è stato studiato l’effetto che l’α-syn e i suoi mutanti patologici (A53T, H50Q, A30P, E46K) hanno sulla generazione e sulla dissoluzione del reticolo di fibrina. Le proteine oggetto di studio sono state espresse in cellule di Escherichia Coli, purificate e caratterizzate chimicamente (spettrometria di massa ad elevata risoluzione) e conformazionalmente (Dinamic Light Scattering, Dicroismo Circolare, Spettroscopia di Fluorescenza). Il complesso α-syn fibrinogeno è stato caratterizzato sfruttando diverse tecniche biofisiche e biochimiche. Infine, l’effetto di α-syn e dei mutanti sulla generazione di fibrina è stato monitorato mediante saggi turbidimetrici su sangue, plasma e fibrinogeno isolato. I dati ottenuti da questo elaborato di Tesi suggeriscono che α-syn e i suoi mutanti interagiscono stabilmente con il fibrinogeno, con affinità rilevanti dal punto di vista fisiologico, rendendo il gel di fibrina più stabile. I risultati ottenuti aiutano a spiegare, da un punto di vista molecolare, perché pazienti affetti da α-sinucleopatie siano maggiormente colpiti da eventi trombotici.