La transtiretina (TTR) è una proteina omotetramerica altamente conservata di 55 kDa che si può trovare nel plasma e nel liquido cerebrospinale. È una proteina carrier coinvolta nel trasporto di ormoni tiroidei (T3 e T4) e del retinolo legato al complesso legante il retinolo (RBP). Dal punto di vista strutturale, la TTR è una proteina di 127 amminoacidi organizzata in un β-sandwich suddiviso a sua volta da due β-foglietti caratterizzati da quattro strand ciascuno e una sola α-elica. Nel tetramero, ogni monomero di TTR interagisce con un’altra subunità formando un dimero. Due dimeri poi si associano formando il tetramero. È noto come la TTR sia soggetta ad un’alta variabilità genetica, presentandosi in più di cento forme derivanti da mutazioni puntiformi del gene relativo. Queste forme sono responsabili dell’insorgenza di ATTR di tipo ereditario, patologia degenerativa caratterizzata dalla deposizione di materiale proteico principalmente a livello del sistema nervoso o del sistema cardiovascolare a seconda della mutazione coinvolta. La specie wild type invece è responsabile dell’ATTR senile, patologia sporadica con esordio tardivo. Nonostante i diversi presupposti, le due forme di ATTR sono accomunate da una tossicità mediata dalla presenza di fibre amiloidi, cioè corpi fibrillari costituiti da TTR full length o frammenti di TTR che si aggregano e si depositano a livello tissutale, compromettendo le funzionalità caratteristiche del tessuto coinvolto. Mentre però l’aggregazione della TTR full length è indotta dalla destabilizzazione della struttura proteica, causata ad esempio da un pH molto acido, la generazione dei frammenti di TTR è determinata dall’attività di proteasi di tipo serinico, come tripsina e plasmina, ma anche enzimi come la subtilisina prodotta dal Bacillus subtlis, batterio commensale appartenente al microbiota intestinale. Particolare interesse suscitano alcuni mutanti della proteina, in cui l’entità dei fenomeni sopra citati risulta aumentata. Alla luce di queste osservazioni, nel laboratorio di ricerca di chimica delle proteine del prof. Vincenzo De Filippis è stato preso in considerazione lo studio riguardante l’effetto che alcune mutazioni genetiche naturali presentano sulla struttura, flessibilità conformazionale, suscettibilità all’attacco proteolitico e tendenza all’aggregazione della transtiretina. In particolare, si è deciso di studiare la TTR wild type e i mutanti V30M, S52P e L55P, prodotti tramite tecniche di biologia molecolare. Le quattro proteine, sono state espresse da colture batteriche di Escherichia coli, purificate mediante cromatografia di affinità IMAC ed RP-HPLC e poi caratterizzate attraverso RP-HPLC, SDS-PAGE e MS ad alta risoluzione. Mediante tecniche spettroscopiche (DLS, Fluorescenza e Dicroismo Circolare) è stata svolta un’analisi conformazionale della rTTR wild type e dei suoi mutanti. Inoltre, è stata condotta un’analisi della suscettibilità proteolitica di rTTR wild type e delle tre varianti impiegando l’enzima Subtilisina, come sonda per provare la maggiore flessibilità conformazionale dei mutanti rispetto alla rTTR wild type. Infine, per valutare quali siano le differenze strutturali che intercorrono tra le quattro proteine è stato eseguito anche un esperimento di spettrometria di massa accoppiata alle tecniche di scambio idrogeno-deuterio.

Effetto di Mutazioni Genetiche Naturali sulla Struttura, Flessibilità Conformazionale, Suscettibilità all'Attacco Proteolitico e Tendenza all'Aggregazione della Transtiretina Umana (hTTR): Implicazioni nella Patogenesi dell'Amiloidosi Familiare da hTTR

MIOLO, SAMANTHA
2021/2022

Abstract

La transtiretina (TTR) è una proteina omotetramerica altamente conservata di 55 kDa che si può trovare nel plasma e nel liquido cerebrospinale. È una proteina carrier coinvolta nel trasporto di ormoni tiroidei (T3 e T4) e del retinolo legato al complesso legante il retinolo (RBP). Dal punto di vista strutturale, la TTR è una proteina di 127 amminoacidi organizzata in un β-sandwich suddiviso a sua volta da due β-foglietti caratterizzati da quattro strand ciascuno e una sola α-elica. Nel tetramero, ogni monomero di TTR interagisce con un’altra subunità formando un dimero. Due dimeri poi si associano formando il tetramero. È noto come la TTR sia soggetta ad un’alta variabilità genetica, presentandosi in più di cento forme derivanti da mutazioni puntiformi del gene relativo. Queste forme sono responsabili dell’insorgenza di ATTR di tipo ereditario, patologia degenerativa caratterizzata dalla deposizione di materiale proteico principalmente a livello del sistema nervoso o del sistema cardiovascolare a seconda della mutazione coinvolta. La specie wild type invece è responsabile dell’ATTR senile, patologia sporadica con esordio tardivo. Nonostante i diversi presupposti, le due forme di ATTR sono accomunate da una tossicità mediata dalla presenza di fibre amiloidi, cioè corpi fibrillari costituiti da TTR full length o frammenti di TTR che si aggregano e si depositano a livello tissutale, compromettendo le funzionalità caratteristiche del tessuto coinvolto. Mentre però l’aggregazione della TTR full length è indotta dalla destabilizzazione della struttura proteica, causata ad esempio da un pH molto acido, la generazione dei frammenti di TTR è determinata dall’attività di proteasi di tipo serinico, come tripsina e plasmina, ma anche enzimi come la subtilisina prodotta dal Bacillus subtlis, batterio commensale appartenente al microbiota intestinale. Particolare interesse suscitano alcuni mutanti della proteina, in cui l’entità dei fenomeni sopra citati risulta aumentata. Alla luce di queste osservazioni, nel laboratorio di ricerca di chimica delle proteine del prof. Vincenzo De Filippis è stato preso in considerazione lo studio riguardante l’effetto che alcune mutazioni genetiche naturali presentano sulla struttura, flessibilità conformazionale, suscettibilità all’attacco proteolitico e tendenza all’aggregazione della transtiretina. In particolare, si è deciso di studiare la TTR wild type e i mutanti V30M, S52P e L55P, prodotti tramite tecniche di biologia molecolare. Le quattro proteine, sono state espresse da colture batteriche di Escherichia coli, purificate mediante cromatografia di affinità IMAC ed RP-HPLC e poi caratterizzate attraverso RP-HPLC, SDS-PAGE e MS ad alta risoluzione. Mediante tecniche spettroscopiche (DLS, Fluorescenza e Dicroismo Circolare) è stata svolta un’analisi conformazionale della rTTR wild type e dei suoi mutanti. Inoltre, è stata condotta un’analisi della suscettibilità proteolitica di rTTR wild type e delle tre varianti impiegando l’enzima Subtilisina, come sonda per provare la maggiore flessibilità conformazionale dei mutanti rispetto alla rTTR wild type. Infine, per valutare quali siano le differenze strutturali che intercorrono tra le quattro proteine è stato eseguito anche un esperimento di spettrometria di massa accoppiata alle tecniche di scambio idrogeno-deuterio.
2021
Effect of Natural Genetic Mutations on the Structure, Conformational Flexibility, Susceptibility to Proteolysis and Aggregation Tendency of Human Transthyretin (hTTR): Implications in the Pathogenesis hTTR-related Familial Amyloidosis
Transtiretina
Aggregazione
Amiloidosi Familiare
Mutazioni
Proteolisi
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.12608/35911