Studio di flavivirus neurotropi mediante l’utilizzo di modelli in vitro derivati da cellule staminali umane

Introduzione: West Nile virus (WNV) e Usutu virus (USUV) sono flavivirus neurotropi filogeneticamente correlati che condividono cicli di trasmissione simili tra diverse specie di uccelli e zanzare appartenenti al genere Culex. USUV è considerato meno patogeno per l'uomo rispetto a WNV, anche se sono stati identificati casi con gravi complicanze neurologiche. Scopo dello studio: Sviluppare un modello di infezione di neuroni in vitro basato sull’utilizzo di cellule staminali umane al fine di indagare e confrontare a livello fenotipico diversi lignaggi di WNV e USUV, i cui genotipi sono ben caratterizzati. Materiali e metodi: Neuroni umani differenziati sono stati derivati da cellule staminali embrionali (linea cellulare H9) trasfettate con il gene inducibile della Neurogenina 2 (H9 AAVS1-TRE3G-NGN2). I neuroni sono stati successivamente infettati con WNV lineage 1, ceppo ITA/09 (GU011992), WNV lineage 2 ceppo AUT/08 (KF179640) e USUV lineage Europe 1 (AY453411) a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,1. I surnatanti e i lisati cellulari sono stati raccolti 24h e 48h dopo l’infezione per indagare la cinetica di replicazione virale mediante RT-qPCR e saggio TCID50 e lo studio dell’espressione di alcuni geni chiave della risposa immunitaria innata, inclusi RIG-I, TLR3, IRF-7, VIPERIN e MX-1. Inoltre, mediante immunofluorescenza indiretta, sono stati caratterizzati i neuroni (mediante anticorpi anti-TUJ-1) ed è stata valutata l’espressione di geni virali (mediante anticorpi anti-E protein). Risultati: Le cellule neuronali differenziate dalla linea H9 sono risultate permissive a tutti e tre i virus, come dimostrato dall’espressione della proteina virale E a 48h dall’infezione. La percentuale di cellule neuronali infettate da WNV (di entrambi i lignaggi) era maggiore rispetto alle cellule USUV-positive (circa il 10-13% delle cellule era positiva per entrambi i ceppi WNV vs circa il 2% di cellule USUV-positive). Le analisi di cinetica virale hanno mostrato come la capacità replicativa di USUV in queste cellule fosse significativamente inferiore rispetto a quella dei virus WNV lignaggio 1 e 2, i quali presentavano una cinetica di replicazione simile e molto efficiente, con titoli che hanno raggiunto 10^11 TCID50/mL. L’analisi della risposta immunitaria innata delle cellule neuronali ha dimostrato l’induzione dell’espressione del gene antivirale Viperin rispetto al mock in risposta a WNV1 e WNV2 ma non in risposta ad USUV. Conclusioni e prospettive future: Le cellule neuronali umane derivate da cellule staminali embrionali pluripotenti rappresentano un modello in vitro utile per studiare il neurotropismo dei flavivirus. Gli esprimenti di infezione eseguiti su questo modello hanno dimostrato che WNV lineage 1 e WNV lineage 2 infettano e replicano più efficientemente di USUV nei neuroni umani, inducendo una risposta immunitaria antivirale innata. Esperimenti di RNA-seq sono in corso per studiare più approfonditamente la risposta cellulare all’infezione virale. Sarà inoltre valutato l’effetto citopatico a time point più lunghi. Infine, saranno ampliati i modelli neuronali in vitro, al fine di studiare l’infezione di astrociti (target preferenziale di WNV in vivo), culture miste e organoidi cerebrale (culture 3D).