Tecniche di indagine sul ruolo della proteinchinasi CK2 nell'atassia di Friedreich

Introduzione. L’atassia di Friedreich (FRDA) è una malattia neurodegenerativa autosomica recessiva causata dal deficit di frataxina, proteina codificata dal gene FXN. Di recente è stato scoperto che la fosforilazione della frataxina da parte della chinasi Src favorisce la sua degradazione. Sulla base di ciò, abbiamo avviato degli studi con lo scopo di verificare se anche la protein-chinasi CK2 favorisce la degradazione della frataxina e se, perciò, l’inibizione di CK2 con CX-4945 può rappresentare un valido approccio terapeutico contro la FRDA. Scopo della tesi. La tesi ha il fine di studiare gli effetti di CX-4945 sui livelli di frataxina matura. Per poter svolgere questa ricerca abbiamo sviluppato due protocolli, per studiare gli effetti sulla frataxina cellulare, e all’interno dei diversi comparti cellulari. Inoltre, si è indagato il meccanismo di regolazione dei livelli di frataxina da parte di CK2. Metodi. Entrambi i protocolli sviluppati si basano sulla trasfezione della frataxina in cellule HEK 293T, e successivo trattamento con CX-4945 a diversi tempi e concentrazioni. Nel primo protocollo si opera una lisi cellulare totale, mentre il secondo prevede il frazionamento delle proteine in base alla loro localizzazione intracellulare mediante centrifugazione differenziale. In entrambi i casi, le proteine vengono poi separate con elettroforesi su gel (SDS-PAGE), trasferite su membrana tramite Western Blot, e analizzate con un anticorpo specifico per la frataxina; la rivelazione avviene con un metodo basato sulla chemiluminescenza. Per studiare il meccanismo di regolazione della maturazione della frataxina sono stati impiegati plasmidi mutanti. Risultati. L’inibizione di CK2 con CX-4945 favorisce la maturazione della frataxina: induce infatti la riduzione del precursore della proteina e l’incremento della forma matura. Ciò avviene in tutti i comparti cellulari, ma è significativo a livello citoplasmatico e nucleare. Un possibile meccanismo di regolazione individuato è lo stato di fosforilazione della Ser206 della frataxina. Conclusioni. I primi dati raccolti sono promettenti per ulteriori studi sull’inibizione di CK2 come strategia terapeutica per la FRDA.