Validazione di un metodo LC-MS/MS per la determinazione del 17-idrossiprogesterone sierico

Introduzione. Il 17-idrossiprogesterone (17-OHP) è un ormone steroideo, precursore del cortisolo che deriva dal colesterolo. La misurazione del 17-OHP può essere utilizzata per la ricerca, diagnosi e monitoraggio della sindrome surrenale-genitale congenita (CAH) e sindrome dell’ovaio policistico (PCOS) e nella diagnosi di tumori surrenalici androgeno-secernenti. Tradizionalmente, i livelli di 17-OHP sierici vengono determinati con test immunometrici manuali e più recentemente automatizzati ma che presentano una bassa specificità analitica e di conseguenza una inaccuratezza diagnostica. L’utilizzo della cromatografia liquida (HPLC) accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) permette di avere un'elevata specificità analitica. Lo scopo di questa tesi è ottimizzare la procedura di preparazione del campione di un metodo “home-made” LC-MS/MS per la determinazione del 17-OHP sierico in modo da renderla implementabile su un preparatore automatico e di poterlo quindi attivare nella routine di laboratorio. Questo metodo poi deve essere validato secondo le linee-guida internazionali, rendendolo conforme allo Standard Internazionale di accreditamento per i laboratori medici ISO 15189:2012. Materiali e metodi. È stata studiata una procedura di preparazione del campione che prevede una fase iniziale di precipitazione proteica (PP) e una seconda fase di estrazione in fase solida (SPE). Questa procedura è stata inizialmente condotta con cartucce Oasis HLB 1 mL (Waters, USA) per poi utilizzare le piastre SPE Oasis HLB 96-well µElution Plate (Waters, USA). I campioni preparati sono stati analizzati sullo strumento LCMS-8060 (Shimadzu, Japan) utilizzando la colonna ACQUITY UPLC HSS T3, 100Å, 1.8 µm, 2.1 mm X 100 mm (Waters). Il metodo è stato validato secondo le principali linee guida internazionali (CLSI C50-P, CLSI C62, FDA 2018) per i parametri di range di misura analitico, specificità, limite di quantificazione, imprecisione, inesattezza, effetto matrice, comparabilità con il metodo immunometrico e stabilità del campione. Risultati. Le prestazioni analitiche ottenute dalle prove di validazione soddisfano i criteri di accettabilità richiesti dalle linee-guida internazionali. La procedura di preparazione del campione ottimizzata ha migliorato la risoluzione dei picchi cromatografici, il rapporto segnale/rumore di fondo e il limite di quantificazione. Il metodo sviluppato non risulta né comparabile né correlato con il metodo immunometrico in routine. Conclusioni. La procedura di preparazione del campione del metodo “home-made” LC-MS/MS per la determinazione dei livelli sierici di 17-OHP è stata ottimizzata per renderla automatizzabile e quindi per poterla implementare nella routine di laboratorio. Il metodo è stato sottoposto a rigorosa validazione secondo le principali linee-guida internazionali e le prestazioni analitiche sono risultate soddisfacenti in base allo scopo d’uso del test.