Introduzione Il sistema CRISPR-Cas9 è una tecnica di editing genetico che si basa sull’utilizzo di una guida a singolo filamento di RNA (single-guide RNA, sgRNA) specifica, che guida l’endonucleasi Cas9 verso una regione di DNA target affinchè questa generi una rottura a doppio filamento (double strand breaks, DSB) sito specifica. Il Coenzima Q (CoQ) è una molecola lipidica che funziona come trasportatore di elettroni dai complessi I e II al complesso III della catena respiratoria mitocondriale. La famiglia di proteine ADCK (aarF domain containing kinase), e in particolare ADCK2, ADCK3 e ADCK4, sono coinvolte nella biosintesi del CoQ, un processo non del tutto definito nell’uomo, mentre le funzioni di ADCK1 e ADCK5 non sono mai state studiate. Scopo dello studio Lo scopo della tesi è quello di generare cellule umane knock-out per il gene ADCK1, attraverso una variante del sistema CRISPR-Cas9, per generare ampie delezioni genomiche. Materiali e metodi Cellule HEK293 sono state trasfettate contemporaneamente con due plasmidi, ognuno codificante per l’endonucleasi Cas9 e una gRNA. In un primo esperimento sono state utilizzate due gRNAs che riconoscevano due siti target negli esoni 5 e 10 del gene ADCK1, mentre nel secondo esperimento sono state sfruttate due gRNAs che riconoscevano due siti target negli esoni 5 e 7 dello stesso gene. Dopo la trasfezione, le cellule sono state selezionate e sono stati isolati dei cloni, il cui DNA è stato analizzato mediante PCR per testare la presenza della delezione; quest’ultima è stata verificata poi con il sequenziamento SANGER. Infine, per confermare ulteriormente l’assenza del prodotto proteico di ADCK1, è stato eseguito un Western blot. Risultati Seguendo questa strategia, sono stati ottenuti tre diversi cloni di cellule HEK293 knock-out per ADCK1, le quali presentano delle delezioni out-of frame, su entrambi gli alleli, che generano una proteina tronca. Il Western blot ha confermato l’assenza del prodotto proteico. Conclusioni L’efficienza della tecnica CRISPR-Cas9 per la generazione di ampie delezioni genomiche è relativamente ridotta e inversamente proporzionale alla all’ampiezza della delezione. Saranno necessari, in futuro, ulteriori caratterizzazioni delle cellule, per definire, con certezza, l’effetto della delezione e, di conseguenza, il ruolo del gene ADCK1 nelle funzioni cellulari.

Generazione di cellule ADCK1 knock-out attraverso la tecnica CRISPR/Cas9

ZAMPIERI, SARA
2021/2022

Abstract

Introduzione Il sistema CRISPR-Cas9 è una tecnica di editing genetico che si basa sull’utilizzo di una guida a singolo filamento di RNA (single-guide RNA, sgRNA) specifica, che guida l’endonucleasi Cas9 verso una regione di DNA target affinchè questa generi una rottura a doppio filamento (double strand breaks, DSB) sito specifica. Il Coenzima Q (CoQ) è una molecola lipidica che funziona come trasportatore di elettroni dai complessi I e II al complesso III della catena respiratoria mitocondriale. La famiglia di proteine ADCK (aarF domain containing kinase), e in particolare ADCK2, ADCK3 e ADCK4, sono coinvolte nella biosintesi del CoQ, un processo non del tutto definito nell’uomo, mentre le funzioni di ADCK1 e ADCK5 non sono mai state studiate. Scopo dello studio Lo scopo della tesi è quello di generare cellule umane knock-out per il gene ADCK1, attraverso una variante del sistema CRISPR-Cas9, per generare ampie delezioni genomiche. Materiali e metodi Cellule HEK293 sono state trasfettate contemporaneamente con due plasmidi, ognuno codificante per l’endonucleasi Cas9 e una gRNA. In un primo esperimento sono state utilizzate due gRNAs che riconoscevano due siti target negli esoni 5 e 10 del gene ADCK1, mentre nel secondo esperimento sono state sfruttate due gRNAs che riconoscevano due siti target negli esoni 5 e 7 dello stesso gene. Dopo la trasfezione, le cellule sono state selezionate e sono stati isolati dei cloni, il cui DNA è stato analizzato mediante PCR per testare la presenza della delezione; quest’ultima è stata verificata poi con il sequenziamento SANGER. Infine, per confermare ulteriormente l’assenza del prodotto proteico di ADCK1, è stato eseguito un Western blot. Risultati Seguendo questa strategia, sono stati ottenuti tre diversi cloni di cellule HEK293 knock-out per ADCK1, le quali presentano delle delezioni out-of frame, su entrambi gli alleli, che generano una proteina tronca. Il Western blot ha confermato l’assenza del prodotto proteico. Conclusioni L’efficienza della tecnica CRISPR-Cas9 per la generazione di ampie delezioni genomiche è relativamente ridotta e inversamente proporzionale alla all’ampiezza della delezione. Saranno necessari, in futuro, ulteriori caratterizzazioni delle cellule, per definire, con certezza, l’effetto della delezione e, di conseguenza, il ruolo del gene ADCK1 nelle funzioni cellulari.
2021
Generation of ADCK1 knock-out cells by CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9
Coenzyme Q
Metabolism
Genetics
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.12608/36277