Determinazione di Etilglucuronide nel capello: validazione di un metodo in HPLC-MS/MS

INTRODUCTION: ethylglucuronide (EtG) is a metabolic product of ethyl alcohol, derived from the conjugation of ethanol with glucuronic acid. EtG is currently measured in urine for monitoring chronic alcohol abuse, but has the limitation of a narrow window of detectability. Because of the need for long-term evaluation of subjects, it was decided to use the hair matrix. PURPOSE OF THE STUDY: the objective of this thesis is to validate an HPLC method coupled with mass spectrometry at the UOC Laboratory Medicine of the Hospital-University of Padua. MATERIAL AND METHODS: sixty patient samples from the License Commission were analyzed, previously extracted and the deuterated internal standard added. The chromatographic column used was a C-18, 15 cm x 2.1 cm x 1.8 um with an Atlantis Premier BEH C18 AX 2.5 μm - 2.1 x 5 mm precolumn (Waters), and mobile phases were provided by the company Comedical. The instrument used is Acquity UPLC associated with an Xevo TQ-S Micro mass spectrometer, both from Waters. The validation process included the evaluation of: precision (intra- and inter-series), accuracy, LLOQ, linearity and stability of the extracted product. RESULTS: linearity was evaluated on 5 calibration points range between 5 and 300 pg/ng). The limit of quantification is 5 pg/ng. Intra- and inter-series imprecision result with CV% of 4.5% and 5.9%, respectively. Linearity evaluation yields a mean R2=0.9993 (n=10) with bias <15%. The accuracy evaluated on three samples at known concentration results in -11%, 0% and -9%. Stability tests, performed on three samples at different concentrations, report a % bias of 6.2%, 0.9% and 0.9%, respectively, demonstrating that ethylglucuronide is an analyte that remains stable for one month when kept at -20°C (-4°F) and up to 5 days at autosampler temperature (10°C or 50°F). CONCLUSIONS: a rapid, sensitive and accurate HPLC-MS/MS method for the determination of ethylglucuronide in hair has been validated. This allows its implementation in the confirmatory analysis of substances of abuse performed by the UOC Laboratory Medicine of the Azienda-Hospital of Padua.

INTRODUZIONE: l’etilglucuronide (EtG) è un prodotto metabolico dell’alcool etilico, derivato dalla coniugazione dell’etanolo con acido glucuronato. Attualmente l’EtG viene misurato nelle urine per il monitoraggio dell’abuso alcolico cronico, ma presenta la limitazione di una ristretta finestra di rilevabilità. Data la necessità di una valutazione a lungo termine dei soggetti si è deciso di utilizzare la matrice pilifera. SCOPO DELLO STUDIO: l’obiettivo di questa tesi è la validazione di un metodo HPLC accoppiato a spettrometria di massa presso l’UOC Medicina di Laboratorio dell’Azienda Ospedale-Università di Padova. MATERIALE E METODI: sono stati analizzati 60 campioni di pazienti provenienti dalla Commissione Patenti, precedentemente estratti e addizionati dello standard interno deuterato. La colonna cromatografica utilizzata è una C-18, 15 cm x 2,1 cm x 1,8 um con una precolonna Atlantis Premier BEH C18 AX 2,5 μm - 2,1 x 5 mm (Waters), e le fasi mobili fornite dalla ditta Comedical. Lo strumento utilizzato è Acquity UPLC associato ad uno spettrometro di massa Xevo TQ-S Micro, entrambi della ditta Waters. Il processo di validazione ha incluso la valutazione di: precisione (intra- e inter-serie), esattezza, LLOQ, linearità e stabilità del prodotto estratto. RISULTATI: la linearità è stata valutata su 5 punti di calibrazione range tra 5 e 300 pg/ng). Il limite di quantificazione è pari a 5 pg/ng. L’imprecisione intra- e inter-serie risultano con un CV% rispettivamente di 4,5% e 5,9%. Dalla valutazione della linearità si ottiene un R2 medio=0,9993 (n=10) con bias <15%. L’esattezza valutata su tre campioni a concentrazione nota risulta del -11%, 0% e -9%. Le prove di stabilità, eseguite su tre campioni a concentrazioni diverse, riportano un bias % rispettivamente pari allo 6,2%, 0,9% e 0,9% dimostrando che l’etilglucuronide è un analita che rimane stabile per un mese se mantenuto a -20°C e fino a 5 giorni alla temperatura dell’autocampionatore (10°C). CONCLUSIONI: è stato validato un metodo rapido, sensibile e accurato di HPLC-MS/MS per la determinazione dell’etilglucuronide nel capello. Questo permette la sua implementazione nelle analisi di conferma delle sostanze d’abuso eseguite dall’UOC Medicina di Laboratorio dell’Azienda-Ospedale di Padova.