Messa a punto di un saggio enzimatico per valutare la topologia di membrana di proteine micobatteriche

Tuberculosis is a very ancient infectious disease, still very widespread in the world. The success of its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, is largely due to its rapid ability to adapt to the numerous stresses it is subjected to during the infection. One of these mechanisms exploits the LysX protein, capable of modifying the surface charge of bacteria making them more resistant to the action of antimicrobial peptides. A LysX orthologous protein, later called LysX2, was recently identified. An obvious difference between the two is the location of the catalytic domain, facing the cytoplasm in the case of LysX, and the periplasmic space in the case of LysX2. To obtain this information, the LysX and LysX2 catalytic domains were associated with the proteins LacZ, active in the cytoplasm, and PhoA, active in the periplasm, whose alternative enzymatic activity was then evaluated. These experiments were carried out in the model organism Escherichia coli, as the possibility of testing in a more specific model for the natural host, such as the non-pathogenic mycobacterium M. smegmatis, is still missing. In this thesis work, the tuberculous proteins mentioned are exploited as a model of already known topology, for the construction of specific plasmids for use in mycobacteria, and the development of this assay. In addition, the expression of the proteins whose topology is to be tested is placed under the control of an inducible promoter, allowing the execution of the assay to be adapted even to different proteins that require a fine and regulated modulation of expression.

La tubercolosi è una patologia infettiva molto antica, ancora parecchio diffusa nel mondo. Il successo del suo agente eziologico, Mycobacterium tuberculosis, si deve in gran parte alle sue rapide capacità di adattamento ai numerosi stress a cui è sottoposto nel corso dell’infezione. Uno di questi meccanismi sfrutta la proteina LysX, in grado di modificare la carica superficiale dei batteri rendendoli più resistenti all’azione di peptidi antimicrobici. Recentemente è stata individuata una proteina ortologa di LysX, poi chiamata LysX2. Una differenza evidente tra le due è la posizione del dominio catalitico, rivolto al citoplasma nel caso di LysX, e allo spazio periplasmatico nel caso di LysX2. Per ottenere questa informazione, ai domini catalitici di LysX e LysX2 sono state associate le proteine LacZ, attiva nel citoplasma, e PhoA, attiva nel periplasma, di cui è stata poi valutata l’attività enzimatica alternativa. Questi esperimenti sono stati effettuati nell’organismo modello Escherichia coli, in quanto manca ancora la possibilità di effettuare il saggio in un modello più specifico per l’ospite naturale, come il micobatterio non patogeno M. smegmatis. In questo lavoro di tesi, le proteine tubercolari citate vengono sfruttate come modello di topologia già nota, per la costruzione di plasmidi specifici per l’utilizzo nei micobatteri, e la messa a punto di tale saggio. Inoltre, l’espressione delle proteine di cui testare la topologia viene posta sotto il controllo di un promotore inducibile, permettendo di adattare l’esecuzione del saggio anche a proteine diverse che necessitino di una modulazione fine e regolata dell’espressione.