Il carcinoma prostatico è il secondo tumore più comune nella popolazione maschile di tutto il mondo. Questa elevata incidenza richiede strategie diagnostiche e terapeutiche sempre più efficienti. Negli ultimi anni si è cercato di sviluppare metodi in grado di rilevare in modo efficace e non invasivo i diversi stadi della patologia, valutare la risposta del paziente ad un trattamento specifico e fornire una terapia mirata e personalizzata. L’antigene di membrana prostatico specifico (PSMA) rappresenta un bersaglio molecolare ideale per applicazioni teranostiche in questo tipo di tumore in quanto è un biomarcatore altamente sovraespresso nelle cellule tumorali prostatiche ed il suo tasso di espressione è correlato all'aggressività della malattia. In questo progetto di Tesi sono stati considerati i frammenti anticorpali a catena singola scFvD2B-noTag e scFvD2B-HisMycTag contenenti la porzione variabile dell’anticorpo IgGD2B ed aventi come target il dominio extracellulare di PSMA. In aggiunta alla sequenza dell’scFv, il frammento scFvD2B-HysMycTag contiene all’estremità C-terminale una sequenza di sei istidine e una sequenza Myc utili per la purificazione. Lo scopo dello studio è quello di ottimizzare protocolli di derivatizzazione chimica ed enzimatica mediante transglutaminasi (mTG) dei due scFv al fine di coniugare in modo sito-specifico chelanti del tecnezio-99m e produrre radiocostrutti utili in medicina nucleare nella diagnostica per immagini SPECT. Gli esperimenti condotti hanno dimostrato che nel frammento scFvD2B-noTag non avviene la derivatizzazione attraverso metodo enzimatico, mentre mediante metodo chimico sono stati legati due diversi derivati dell’idrazinonicotinamide, S-Hynic e Hynic-GGC. Questi due coniugati sono stati radiomarcati con 99mTc utilizzando come coligandi EDDA e Tricina e per il radiocomplesso [99mTc][NaTcO4(S-Hynic)(EDDA-Tricina)(scFvD2B-noTag)] è stata valutata la stabilità in vitro. La resa di marcatura è risultata soddisfacente mentre la stabilità in vitro è elevata. Studi precedenti hanno dimostrato che il frammento scFvD2B-HisMycTag è suscettibile a derivatizzazione mediante mTG portando alla formazione di un mono-derivato. In questa Tesi, mediante spettrometria di massa si è dimostrato che il sito di derivatizzazione è localizzato a livello del residuo di glutammina della sequenza Myc. Mediante mTG, si è quindi prodotto un derivato di scFv coniugato con un tetrapeptide contenente un residuo di cisteina utile per legare 99mTc. Dopo purificazione, sono state ottimizzate le condizioni di marcatura del prodotto derivatizzato con il sintone [99mTc][TcN(PNP3OH)]2+. Successivamente è stata valutata in vitro la stabilità del radioimmunoconiugato ottenuto che è risultato stabile nei confronti di agenti transchelanti (Cisteina, EDTA, Glutatione). I risultati ottenuti per i due radioimmunoconiugati pongono delle basi per successivi studi di captazione cellulare e studi in vivo.
OTTIMIZZAZIONE DI METODI DI DERIVATIZZAZIONE ENZIMATICA E CHIMICA PER LA RADIOSINTESI DEL FRAMMENTO ANTICORPALE scFvD2B FINALIZZATO ALL’IMAGING SPECT DEL CARCINOMA PROSTATICO
FILOSOFO, MARIANNA
2021/2022
Abstract
Il carcinoma prostatico è il secondo tumore più comune nella popolazione maschile di tutto il mondo. Questa elevata incidenza richiede strategie diagnostiche e terapeutiche sempre più efficienti. Negli ultimi anni si è cercato di sviluppare metodi in grado di rilevare in modo efficace e non invasivo i diversi stadi della patologia, valutare la risposta del paziente ad un trattamento specifico e fornire una terapia mirata e personalizzata. L’antigene di membrana prostatico specifico (PSMA) rappresenta un bersaglio molecolare ideale per applicazioni teranostiche in questo tipo di tumore in quanto è un biomarcatore altamente sovraespresso nelle cellule tumorali prostatiche ed il suo tasso di espressione è correlato all'aggressività della malattia. In questo progetto di Tesi sono stati considerati i frammenti anticorpali a catena singola scFvD2B-noTag e scFvD2B-HisMycTag contenenti la porzione variabile dell’anticorpo IgGD2B ed aventi come target il dominio extracellulare di PSMA. In aggiunta alla sequenza dell’scFv, il frammento scFvD2B-HysMycTag contiene all’estremità C-terminale una sequenza di sei istidine e una sequenza Myc utili per la purificazione. Lo scopo dello studio è quello di ottimizzare protocolli di derivatizzazione chimica ed enzimatica mediante transglutaminasi (mTG) dei due scFv al fine di coniugare in modo sito-specifico chelanti del tecnezio-99m e produrre radiocostrutti utili in medicina nucleare nella diagnostica per immagini SPECT. Gli esperimenti condotti hanno dimostrato che nel frammento scFvD2B-noTag non avviene la derivatizzazione attraverso metodo enzimatico, mentre mediante metodo chimico sono stati legati due diversi derivati dell’idrazinonicotinamide, S-Hynic e Hynic-GGC. Questi due coniugati sono stati radiomarcati con 99mTc utilizzando come coligandi EDDA e Tricina e per il radiocomplesso [99mTc][NaTcO4(S-Hynic)(EDDA-Tricina)(scFvD2B-noTag)] è stata valutata la stabilità in vitro. La resa di marcatura è risultata soddisfacente mentre la stabilità in vitro è elevata. Studi precedenti hanno dimostrato che il frammento scFvD2B-HisMycTag è suscettibile a derivatizzazione mediante mTG portando alla formazione di un mono-derivato. In questa Tesi, mediante spettrometria di massa si è dimostrato che il sito di derivatizzazione è localizzato a livello del residuo di glutammina della sequenza Myc. Mediante mTG, si è quindi prodotto un derivato di scFv coniugato con un tetrapeptide contenente un residuo di cisteina utile per legare 99mTc. Dopo purificazione, sono state ottimizzate le condizioni di marcatura del prodotto derivatizzato con il sintone [99mTc][TcN(PNP3OH)]2+. Successivamente è stata valutata in vitro la stabilità del radioimmunoconiugato ottenuto che è risultato stabile nei confronti di agenti transchelanti (Cisteina, EDTA, Glutatione). I risultati ottenuti per i due radioimmunoconiugati pongono delle basi per successivi studi di captazione cellulare e studi in vivo.File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.12608/42342