Studio del profilo farmacologico di analoghi dell'endomorfina-2 sul recettore mu oppioide

Il recettore mu oppioide è un recettore a sette eliche transmembrana accoppiato a proteina G inibitoria. Il recettore mu rappresenta il target di azione dei farmaci analgesici oppioidi. Tali farmaci rappresentano i più efficaci agenti analgesici ma la loro azione è accompagnata da importanti effetti collaterali come costipazione, depressione respiratoria e tolleranza che ne limitano l’utilizzo a lungo termine. In questa tesi è stato studiato il profilo farmacologico di 13 analoghi del peptide oppioide naturale endomorfina-2 (EM-2) con lo scopo di valutare la loro capacità di promuovere l’interazione del recettore mu con proteina G e β-arrestina 2. Discriminare questi due tipi di interazione può essere importante non solo da un punto di vista della conoscenza della trasduzione del segnale ma anche nella predizione ed interpretazione degli effetti biologici in vivo. I composti sono stati testati nel saggio di Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) il quale permette di misurare l’interazione recettore-proteina G e recettore-β-arrestina 2 in presenza di concentrazioni crescenti di ligando. Il legame recettore-proteina G è stato studiato in membrane ottenute da linee cellulari di neuroblastoma umano SH-SY5Y trasdotte stabilmente con le fusoproteine mu-Rluc e Gβ1-RGFP, mentre l’interazione recettore-β-arrestina 2 è stata valutata in cellule intere trasdotte in questo caso con le fusoproteine mu-Rluc e β-arrestina 2-RGFP. Sono stati determinati i valori di potenza ed efficacia dei diversi ligandi ed è stata valutata e calcolata la differenza tra l’attivazione delle due vie di signalling per ciascun peptide. I risultati sono stati espressi utilizzando l’endomorfina-2 come standard di riferimento. Sulla base dei dati ottenuti è possibile notare che i valori di potenza del peptide naturale EM-2 (Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2) sono simili in entrambe le vie di segnalazione, mentre la sostituzione di Tyr1 con Dmt1 ha provocato un aumento di potenza in tutti i peptidi sulla proteina G. I valori di efficacia di tutti gli analoghi, confrontati con EM-2, hanno mostrato un valore compreso tra 0.68 e 1.11 sulla proteina G suggerendo che le modifiche apportate non hanno determinato differenze sostanziali in termini di efficacia. Per quanto riguarda il legame del recettore mu con la β-arrestina 2 la medesima sostituzione ha determinato un aumento di potenza ed ha causato una maggiore variabilità in termini di efficacia, da molto debole/inattivo (<0.1) ad agonista pieno. I risultati ottenuti dal calcolo del bias factor hanno mostrato che gli analoghi 4 e 5 (rispettivamente Tyr-Nip-Phe-Phe-NH2 e Dmt-Nip-Phe-Phe-NH2) sono risultati essere non biased rispetto ad EM-2. In particolare il composto 5 ha mostrato un alto valore di potenza con entrambi i trasduttori a parità di assenza di selettività funzionale. Tutti gli altri peptidi, invece, sono risultati essere biased verso la proteina G. In particolare l’analogo 11 (Dmt-Pro-β2-1-Nal-Phe- NH2) è risultato essere quello maggiormente biased verso la proteina G, seguito dall’analogo 10 (Tyr-Pro-β2-1-Nal-Phe-NH2), 2 (Tyr-Pip-Phe-Phe-NH2) e 6 (Tyr-β2-Ala-Phe-Phe-NH2). In conclusione, tali composti potranno quindi essere utili per ulteriori studi volti a determinarne il profilo analgesico in vivo e più in generale a comprendere il valore della “selettività funzionale” quale strategia farmacologica per generare farmaci analgesici innovativi meglio tollerati rispetto ai composti disponibili in terapia.